PDF《遗传多样性*》

2008 年1―6 月期 间取自渤海、黄海、东海海域, 采集地点分别辽宁大 连(DL)、山东烟台(YT)、青岛(QD)、江苏连云港 (LYG)、 浙江舟山(ZS)、 温州(WZ)、 福建厦门(XM), 样 本取新鲜肌肉保存于 95%酒精, 带回实验室备用. 1.2 DNA 的提取、扩增及测序 取长蛸外套肌组织, 采用《分子克隆实验指南》 (Sambrook et al, 2002)蛋白酶 K、酚/氯仿提取法(稍作 修改)提取基因组 DNA. 细胞色素氧化酶亚基Ⅲ和线粒体DNA 12S rRNA 基因片断的扩增引物源自文献(Allcock et al, 2008), COⅢ基因片段的两条引物分别为: F1 (5′ CAATG ATGAC GAGAT ATTAT YCG 3′), R1 (5′ TCAAC AAAGT GTCAG TATCA 3′);

12S rRNA 基因 片段的两条引物分别为: F2 (5′ AAGAG CGACG GGCGA TATGT A 3′), R2 (5′ AGACT AGGAT TAGAG ACCCT ATTA 3′);

引物由上海英骏生物技术 公司合成.PCR 反应体系为: 总体积 25?l, 其中 ddH2O 13.75?l, 2.5mmol/L dNTPs 2.5?l, 10*buffer 2.5?l, 5U/?l Taq DNA polymerase 0.25?l, 20mmol/L Mg2+ 2?l, 10?mol/L 引物各 1?l, 模板 DNA 溶液(10― 100ng/?l) 2?l;

循环条件为: 94℃预变性 5min, 94℃ 40s, 50℃ 40s, 72℃ 90s,

38 个循环后, 72℃延伸 10min.两个基因的 PCR 反应条件相同. PCR 扩增产物纯化后送交上海英骏生物技术公 司测序. 1.3 数据分析 序列结果利用 MEGA3.1 软件中的 Clustal X 插件 进行 DNA 序列排列, 并辅以人工较对.用MEGA3.1 软件进行序列比较和变异检测, 确定变异位点和单 倍型.用DnaSP4.10 软件计算核苷酸多样性(Nucleotide diversity, ?)、单倍型多样性(haplotype diversity, h)和 核苷酸歧异度(Pairwise divergence).用Arlequin3.01 软件中的分子变异分析(AMOVA)方法估算遗传变异 在群体内和群体间的分布, 并计算群体间遗传分化 系数(F-statistics, Fst)及其显著性(重复次数 1000), 种 群间基因流用 Nm 来估计: Nm = (1/ Fst ??1) /2.

2 结果 2.1 12S rRNA 基因序列分析结果 经PCR 扩增, 得到 12S rRNA 基因片段的扩增产 物, 经测序, 除去引物及部分端部序列, 得到可清楚 判读的碱基数为 416bp.各群体长蛸 12S rRNA 基因 片段中 T、A、C、G 平均含量分别为 36.7%、44.4%、 12.5%和6.4%, A+T 含量(81.1% )明显高于 G+C 含量 (18.9% ). 12S rRNA 基因序列经 DNAsp4.10 软件分析显示,

80 个个体共检测到

46 个变异位点, 占分析位点总数 的11.1%, 其中单突变位点

6 个, 简约信息位点

40 个.同时还检测到

76 个插入或缺失位点, 碱基插入 或缺失主要发生在 314―405bp 之间的区域, 以TA 重 复片段的形式进行.多态性遗传参数统计显示,

80 个 个体共检出

64 个单倍型(表1), 总群体单倍型多样性 指数(Hd)为0.984, 核苷酸多样性指数(Pi) 0.028, 平均 核苷酸差异数(K) 9.403, 显示出较丰富的遗传多样性. 遗传结构分析方面,

7 个群体的 12S rRNA 基因序 列比较结果表明, 各群体在核苷酸组成上和遗传参 数上均存在显著差异.温州、厦门群体在核苷酸组成 上与其它群体存在显著差异, 如表

1 所示.遗传参数 统计表明, 各群体多态位点比例在 1.20%―2.89%之间;

单倍型多样性指数在 0.934―1.000........