PDF《Pfu DNA 聚合酶使用方法》

1 Pfu DNA 聚合酶使用方法 我们推荐您使用本公司免费赠送的 PCR 染料,一是使扩增反应更趋优化;

二是扩增完 毕无需再加上样染料,可直接上样电泳.

1. 建议在 0.2ml 或0.5ml PCR 反应管中加入下列成分: 20?l 反应体系 50?l 反应体系 DNA 模板 5~50ng 10~100ng 上游引物 10~20pmol 20~50pmol 下游引物 10~20pmol 20~50pmol Pfu DNA 聚合酶 1~1.5U 2~3U 10*Pfu 缓冲液 2?l 5?l PCR 染料 2?l 5?l dNTPs(10mM) 0.5?l 1?l 2. 补超纯水至 20?l 或50?l,充分混匀后短暂离心.若基因扩增仪不防蒸发,加入 1~2 滴 石蜡油. 3. 推荐的 PCR 扩增条件(仅供参考) : 94℃ 2.5min 94℃ 45sec 50~65℃ 1min 72℃ 1.5min 72℃ 5~10min 常见问题解答 1. 使用 Pfu 可以扩增多长的片段? 对于简单的模板,Pfu 应该可以很好的扩增 3kb 以下的片段.扩增更长片段时,能否成 功扩增主要与模板和引物的设计有关. 25~35 Cycles

2 2. 使用 Pfu 进行 PCR 扩增后的 PCR 产物能否进行 TA 克隆? 不能直接进行 TA 克隆.首先要将 PCR 产物进行纯化,然后在 dATP 存在条件下用 Taq 酶72℃处理

15 分钟进行 3'末端加 A 处理,再与 TA 载体连接. 3. 用同单位的 Pfu 和Taq 扩增,为什么 Pfu 扩增效率比 Taq 酶低? 因为高保真性能的 Pfu 聚合酶具有 3'到5'核酸外切酶的活性, 扩增过程中如果产生了错 配的碱基,它可以将其切掉,从而保证了扩增的准确性.正是由于此酶具有核酸外切酶 的功能,往往扩增效率比 Taq 要低,而且还容易降解引物,因而在设置 PCR 反应时, 应最后加入 Pfu 酶为好. 三种耐热 DNA 聚合酶比较 耐热聚合酶 特点及应用 Taq DNA Polymerase ? 延伸速度最快的耐热 DNA 聚合酶,理想状态下为 2~4kb/min.可以很好的扩增 10kb 以下的 DNA 片段. ? 用于普通 PCR 扩增,其PCR 产物含 3′端单个 dA, 能进行 TA 克隆. Taq-red DNA Polymerase ? 除具有普通 Taq DNA Polymerase 的特点外,该酶 呈红色, 加取样易于观察更方便;

PCR 完成后可直 接电泳,无需再加上样染料. ? 用于普通 PCR 扩增,其PCR 产物含 3′端单个 dA, 能进行 TA 克隆. Pfu DNA Polymerase ? DNA 聚合时的保证延伸速度 600bp/min,该酶具有 独特的 3′→5′外切核酸酶活性,能修正错配碱基, 从而保证 DNA 扩增的高保真度. 适用于高保真扩增 长度为 3kb 以下的片段. ? 保真度要求较高,片段比较短,如点突变、基因筛 选等. 北京赛百盛基因技术有限公司 全国统一热线:400

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