PDF《One-step RT-PCR Kit for》

Order: 010-59822688 Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.

, LTD 本产品仅供科研使用.请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途. 版本号: SD121221 产品内容 产品组成 SD102

50 μl*50 rxn Hotmaster Taq polymerase (2.5 U/?l)

130 ?l Quant RTase (for One-step)

30 ?l RNasin (40 U/?l)

30 ?l 10xsdRT-PCR Buffer

300 ?l Super Pure dNTPs (10 mM each)

120 ?l RNase -Free ddH2O 2*1ml 5xRT-PCR enhancer

600 ?l 储存条件 该试剂盒请置于-20℃保存. One-step RT-PCR Kit for Virus Detection 病毒检测用一步法RT-PCR试剂盒 目录号:SD102 产品简介 RT-PCR是指利用逆转录酶将RNA逆转录 (RT)成cDNA,然后以cDNA为模板,通过 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段的技术.RT-PCR技术可用于检测细胞和组织中基因表 达水平,克隆特定基因的cDNA序列和检测RNA病毒. 本试剂盒采用一步法使RT和PCR在同一反应体系中进行,反应过程中不需要添加试剂, 无需打开管盖,避免了污染,同时提高了检测的灵敏度.Quant One-Step RT-PCR Kit(一步 法试剂盒)采用高质量逆转录酶(Quant RTase)和热启动HotMaster Taq DNA聚合酶,并采用 我公司研发的反应体系保证Quant RTase和Hotmaster Taq发挥最大功效. 需自备的试剂 1. RNA模板 2. 特异性PCR引物 使用注意事项 1. 建议使用TIANGEN公司生产的病毒检测用RNA提取试剂盒(SD101)来制备高质量的病 毒RNA,以做为RT-PCR模板. 2. 经实验证明:针对复杂模板低丰度的基因,50 ?l体系加入终浓度为0.5?M oligo dT能够适 当提高反转录效率. 3. 经试验证明:针对某些复杂模板或高GC含量低丰度的基因片段的扩增可以通过调整反转 录温度来达到很好的扩增效果. 4. 一步法RT-PCR 实验应避免RNase污染,可采用以下措施: 1) 因人的皮肤表面和唾液都有RNase,因此实验中应戴一次性手套和口罩;

2) 一步法RT-PCR 实验应使用专门的仪器和耗材,建议在专门区域操作RNA;

3) 一步法RT-PCR 实验相关耗材应用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理

12 h,并高压灭菌30 min后使用. 5. Quant RTase、RNasin 和Hotmaster Taq聚合酶在取用之前应短暂离心收集溶液后再吸 取,吸取时动作要慢,使用后应尽快放回-20℃. 6. dNTP 应避免反复冻融以免失效. 7. 本试剂盒必须使用特异性引物,引物的选择可根据具体实验来选择. 8. 为避免非特异扩增,一步法反应液的配制应始终在冰浴中进行,待PCR仪器温度达50℃ 时再将反应管放到仪器中. 9. 引物设计的好坏直接影响到RT-PCR反应的结果,设计引物时需考虑GC含量,引物长 度,引物位置等因素,建议采用专业的引物设计软件来设计. 实验操作步骤 1. 完全融化模板RNA,特异性引物,dNTP mix, 10*sdRT-PCR Buffer, RNase-Free ddH2O 和5*RT-PCR Enhancer,短暂离心后置于冰浴上. 2. 按下表在冰浴条件下配制反应液 反应成分 体积 10*sdRT-PCR Buffer

5 ?l Super Pure dNTPs (10 mM each)

2 ?l 5*RT-PCR Enhancer

10 ?l RNasin (40 U/?l) 0.5 ?l Hotmaster Taq Polymerase (2.5 U/?l) 2.5 ?l Quant RTase (for One-step) 0.5 ?l 上游特异性引物(10 ?M)

3 ?l 下游特异性引物(10 ?M)

3 ?l RNA模板

10 ng-1 ?g total RNA RNase-Free ddH2O 补水至50 ?l 总体系

50 ?l 注意:当同时需要进行多次RT-PCR反应时,将各组分加倍混合后再分装到每个反应 管中,可以减少实验操作产生的误差,使所取的试剂体积更准确,减少试剂损 失. 3. 启动PCR仪器直到温度上升至50℃时,将反应管放入PCR仪器中. 4. 按下表设置PCR反应条件: 步骤 反应 时间 温度