PDF《柿属植物基因组 DNA 提取方法比较》

Vol.

32 No.

4 Apr.

2012 第32 卷第4期2012 年4月中南林业科技大学学报Journal of Central South University of Forestry &

Technology 收稿日期:2011-09-16 基金项目:林业公益性行业科研专项项目 柿属植物种质资源保护与选育技术研究 (200904041) 作者简介:梁玉琴 (1986―),女,硕士研究生,研究方向:经济林栽培育种;

E-mail:[email protected] 通讯作者:李芳东 (1963―),男,河南太康人,博士后,研究员 , 主要从事经济林育种与栽培的研究;

E-mail:[email protected] 我国柿属Diospyros L.植物资源丰富, 有57种,

6 变种,1 变型 [1] ,其中作为果树果树栽培的柿属 植物主要是柿 D.kaki、美洲柿 D.virginiana、君迁 子D.lotus、油柿 D.oleifera 等,尤其以柿综合经济 开发价值最高 [2] .柿是原产于我国的重要木本粮油 树种之一,资源丰富,分布范围广,品种近千余 种[3-4] .近年来,随着分子生物学的高速发展,分子 标记和基因工程等生物技术广泛应用于柿属植物种 质资源鉴定和遗传多样性分析等方面 [5-7] ,而获得高 质量的 DNA 是柿属植物分子生物学研究的基础.柿 属植物叶片富含单宁、多糖、VC 等物质 [8] ,采用常 规CTAB 法提取的 DNA,质量低杂质多 [9-10] ,目前 对柿属植物基因组 DNA 的提取,一般是探索后根 据各自实验条件采用改良 CTAB 法[11-13] ,其操作 繁琐、耗时长、毒害大、效率低,为了快速获得 高质量 DNA,本试验采用改良 CTAB 法和植物基 因组提取试剂盒两种方法提取柿属植物 DNA,比 较两种方法的优劣,以期得到满足柿属植物 SSR- PCR 扩增要求的 DNA 提取适宜方法,为柿属植物 遗传多样性的 SSR 分析研究奠定基础. 柿属植物基因组 DNA 提取方法比较 梁玉琴

1 , 李芳东

1 , 傅建敏

1 , 乌云塔娜

2 , 吴硕1(1. 中国林业科学研究院经济林研究开发中心,河南 郑州 450003;

2. 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室,湖南 长沙 410004) 摘? 要:针对柿属植物叶片富含单宁,常规 CTAB 法提取 DNA 质量低等问题,为了获得符合柿属植物 SSR- PCR 扩增要求的 DNA,分别采用改良 CTAB 法和植物基因组 DNA 提取试剂盒两种方法,提取柿属植物 DNA, 结果显示:两种方法均可得到满足 SSR-PCR 扩增要求的 DNA;

试剂盒较改良 CTAB 法提取的 DNA 质量高、杂 质少,DNA 得率略低,但其操作步骤简单,耗时短,毒害小,因其费用较改良 CTAB 法高,各实验室可根据自 身条件选择适宜方法提取柿属植物 DNA. 关键词:柿属植物,DNA 提取,改良 CTAB 法,基因组 DNA 提取试剂盒 中图分类号: S718.46 文献标志码:A 文章编号:1673-923X(2012)04-0170-04 Comparison of two methods to extract DNA from trees of Diospyros L. LIANG Yu-qin1 , LI Fang-dong1 , FU Jian-min1 , WUYUN Ta-na2 , WU Shuo1 (1. Non-timber Forest Research and Development Center of Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou

450003 , Henan, China;

2. The Key Lab of Non-wood Forest Product of Forestry Ministry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha

410004 , Hunan, China) Abstract: Tannin is rich in the leaves of Diospyros L. so the quality of DNA extracted by conventional CTAB methord is lower. The DNA from trees of Diospyros L. was extracted by using modified CTAB method and plant genomic DNA Kit in order to compare which method is better. The results show that DNA extacted by the two methods also met demands for ssr-pcr amplification. The quality of DNA obtained by plant genomic DNA Kit was better but the achievement rate of DNA was lower. Moreover, the method of plant genomic DNA Kit was much easier, needed shorter time, had lower toxicity. DNA of trees of Diospyros L. can be extracted by suitable method according to the actual conditions of the lab. Key words: Diospyros L.;

DNA extraction;

modified CTAB methord;

plant genomic DNA Kit

171 第32 卷中南林业科技大学学报1试验材料 柿属植物8种 (或变种) , 共22份材料 (见表1) , 其中包括君迁子

2 个类型,柿品种

4 个类型(完 全甜柿

4 个、不完全甜柿

2 个、不完全涩柿

2 个、 完全涩柿

5 个).于6月下旬采摘当年生已展开 的成熟嫩叶,液氮保存带回实验室,置于 -70℃保 存备用. 迅速转移至步骤(1)的离心管中,样品 65℃水浴 裂解

2 h,期间振荡混匀

3 ~

5 次;

(3) 取出离心管冷却,室温

12 000 rpm 离心

12 min;

(4) 将上清液(约700 μL)转入新的 1.5 mL 离 心管中,加入

700 μL 氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1),轻轻 颠倒混匀

10 min,4℃下12

000 rpm 离心

10 min;

(5) 重复步骤 (4)

2 ~

3 次, 直至无白色沉淀层;

(6) 将上清液转入另一 1.5 mL 离心管中,加入

700 μL 预冷的异丙醇,轻轻混匀至出现透明絮状 DNA 沉淀,4℃

10 000 rpm 离心

6 min,弃上清液;

(7) 加入

1 000 μL 预冷的 75%乙醇,洗涤沉淀

2 次,每次

10 000 rpm 离心

6 min,弃乙醇,室温 风干至乙醇完全挥发;

(8) 加入

500 μLM NaCl,充分溶解 DNA 后,加入

2 μLRNase(10 mg/mL),37℃水浴

1 h;

(9) 加入

1 mL 无水乙醇,混匀后 -20℃沉淀 DNA15 h;

(10)4℃

8 000 rpm 离心

10 min,弃上清液, 75%乙醇洗涤 DNA

2 次,每次

8 000 rpm 离心

6 min,弃乙醇,室温风干至乙醇完全挥发;

(11) 加200 μL TE 缓冲液溶解DNA, 置于-20℃保存备用. 2.1.2 植物基因组 DNA 提取试剂盒 植物基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科 技(北京)有限公司,按试剂盒说明书步骤,提 取柿属植物基因组 DNA 后, 置于 -20℃保存备用. 2.2 DNA 检测 2.2.1 琼脂凝胶电泳 取DNA 样品3μL 与1μL 6*Loading buffer 混匀后上样,2% 琼脂糖凝胶(含荧光染料 EB) 电泳检测DNA 质量,100 bp Marker

3 μL, 1*TAE 电泳缓冲液,120 V 电泳

45 min,电泳结 束后,Bio-Rad 凝胶成像系统下观察照相,浓度未 达到要求的样品重新提取 DNA. 2.2.2 SSR―PCR 扩增 利用柿属植物 SSR 引物 ssrDK16[14] 对1~6号样品共

12 份DNA 样品进行 PCR 扩增,PCR 反 应试剂采用 2*Taq Mix(未加染料),购自天根 生化科技(北京)有限公司,引物由南京金斯瑞 神武科技有限公司合成. PCR 反应体系为:DNA 模板2μL( 约40 表1供试柿属植物试验材料 Table

1 The samples of Diospyros L. for the experiment 编号 样品名称 类型 简称

1 君迁子 种D.lotus

2 浙江野柿 柿变种 D.kaki var. silvestris

3 浙江柿 种D.glaucifolia

4 无核君迁子 种D.lotus

5 湖南乌柿 种D.cathayensis

6 油柿 种D.oleifera

7 美洲柿 种D.virginiana

8 云南野毛柿 种 未知

9 阳丰 完全甜柿 PCNA

10 早秋 完全甜柿 PCNA

11 罗田甜柿 完全甜柿 PCNA

12 甜宝盖 完全甜柿 PCNA

13 麻城秋焰 完全甜柿 PCNA

14 藤八 不完全甜柿 PCA

15 禅寺丸 不完全甜柿 PCA

16 平核无 不完全涩柿 PVA

17 大平核 不完全涩柿 PVA

18 南京铜盆 完全涩柿 PVNA

19 橘蜜柿 完全涩柿 PVNA

20 大磨盘 完全涩柿 PVNA

21 博爱八月黄 完全涩........