PDF《兔膈肌骨骼肌型 D HPR》

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2000204220 Accepted

2000207220 3 This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (No139470326) .

33 Corresponding author. Tel :

010266343161 ;

E2mail : suiyangzhang @yahoo1com 生理学报 , Dec.

2000 ,

52 (6) : 497~501

497 Acta Physiologica Sinica 兔膈肌骨骼肌型 D HPR α1亚单位和 RyRs 的mRNA 与蛋白表达测定

3 张睢扬

3 3 , 刘刚,王东林 , 郭先健 , 钱桂生 (第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所 , 重庆 400037) 摘要:本文测定了兔膈肌钙释放单位中骨骼肌型 DHPR α 12亚单位和 RyRs 的mRNA 与蛋白表达水平 , 探讨了 兔膈肌钙释放单位的结构组成特征.采用 RT 2PCR、 原位杂交和免疫组织化学技术 , 分别测定兔膈肌骨骼肌型 DHPR α

12 亚单位和 RyR1 、 RyR2 及RyR3 的mRNA 与蛋白表达.结果显示 , 兔膈肌可见较高水平的骨骼肌型 α 12亚单位 和RyR1mRNA 与蛋白表达 ;

较低水平的 RyR3 mRNA 与蛋白表达. 表明兔膈肌钙释放单位由骨骼肌型 DHPR、 RyR1 和RyR3 构成 , Ca2 + 释放可能具有变构耦联和 CICR 耦联两种形式 , RyR3 的存在可能是膈肌 ECC 依赖于细胞外 Ca2 + 的主要原因. 关键词 : 膈肌 ;

钙释放单位 ;

DHPR ;

RyR ;

Ca2 + 学科分类号 : Q73 mRNA and protein expression of skeletal DHPR α

1 and RyRs in diaphragm muscle of rabbits

3 ZHANG Sui2Yang3

3 , LIU Gang , WANG Dong2Lin , G UO Xian2Jian , QIAN Gui2Sheng ( Institute of Respiratory Diseases of the New Bridge Hospital , The Third Military Medical University , Chongqing 400037) Abstract : T o detect mRNA and protein expression of skeletal dihydropridine receptor isoform alpha1 subunit and ryanodine receptor

1 and

3 in diaphragm muscle of rabbits , the coupling mode and characteristics of Ca2 + release were explored. Reverse transcription PCR , in situ hybridization and immunohistochemical methods were employed. A higher level of mRNA and protein expression of DHPR α

1 and RyR1 , and a lower level of mRNA expression of RyR3 were found. It is suggested that the calcium release unit may consist of skeletal DHPR isoform , RyR1 and RyR3 , and there may be two kinds of Ca2 + release mode via conformational changes in linked proteins and Ca2 + 2induced Ca2 + release (CICR) in diaphragm muscle of rabbits. Key words : diaphragm muscle ;

calcium release unit ;

DHPR ;

RyR ;

Ca2 + 在横纹肌细胞中 , 钙信号依赖于两个膜结构中 的钙释放单位 , 即细胞膜中的二氢嘧啶受体(DHPR) 和肌浆网(SR) 膜中的 Ryanodine 受体(RyR) 的信息交 流[1 ,2] .近年来发现 , 骨骼肌和心肌的 DHPR 和RyR 有不同的亚型分布 , 钙释放单位的耦联模式存在着 明显差异[1~3] .在骨骼肌中 , 骨骼肌型 DHPR 通过 直接耦联或/ 和变构耦联效应导致 RyR1 释放 Ca2 + ;

而心肌则通过心肌型DHPR , 以Ca2 + 致Ca2 + 释放 (CICR) 方式使 RyR2 激活.尽管膈肌属于骨骼肌 , 但它显示出心肌和非呼吸骨骼肌的一些特性 : 一方 面,膈肌像心脏一样节律性地收缩终生 ;

另一方面 , 膈肌受神经驱动 , 有与骨骼肌一样工作的特征.一 些研究已涉及到正常和病理状态下膈肌纤维的解剖 和收缩性质改变[4 ,5] , 同时已知膈肌收缩依赖于细 胞外 Ca2 + 浓度 , Ryanodine 等能改变其收缩和 Ca2 + 瞬时特征[6 ,7] . 但它为什么与其它骨骼肌不同 , 收缩 张力的产生需要细胞外 Ca2 + 存在 , 而这与钙释放单 位有何关系等问题研究较少.基于这个目的 , 本实 ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 验测 定了膈肌骨骼肌型DHPR α 12亚单位和RyRs mRNA 和蛋白水平的表达形式 , 以探讨膈肌钙释放 单位的结构组成特征.

1 材料和方法

111 材料及主要试剂 日本大白兔

6 只,年龄

4 ~6 月,体重 210~215 kg , 雌雄不拘 , 处死即取膈 肌,用同一标本分别进行 RT2PCR、 原位杂交和免疫 组织化学检测.总RNA 提取试剂盒、 脱氧核糖核苷 酸(dNTP) 和地高辛末端引物标记试剂盒由德国宝灵 曼公司提供 ;

RNA 酶抑制剂 (RNAase inhibitor) 、 DNA 聚合酶 ( Taq DNA polymerase) 和寡脱氧胸苷酸引物 (Oligo DT15) 由Promega 公司提供 ;

逆转录酶(Reverse transcriptase , MMLV) 由GIBCO 公司提供;

RyR1 、 RyR2 、 RyR3 和骨骼肌型 DHPR α 12亚单位寡核苷酸引 物分别由中国科学院上海细胞研究所和癌基因研究 所合成 ;

PCR 分子量标记物 (PCR marker) 由华美生 物工程公司提供.RyR 抗血清由 F1Anthony Lai 博士 惠赠(From The Medical Research Council , National In2 stitute for Medical Research , United Kingdom) , 含RyR1 和RyR3 抗体 ;

RyR1 单克隆抗体由 Kevin P1Campbell 博士 惠赠(From The Department of Pharmacology , School of Medicine , University of Washington , USA) ;

骨 骼肌 型DHPR α 12亚单位单克隆抗体由William A1Catterall 惠赠 (From the Department of pharmacology , school of Medicine , University of Washington , USA) .原 位杂交有关试剂 : 蛋白酶 K、 去离子甲酰胺、 硫酸葡 聚糖、 聚乙烯吡咯烷酮、 变性鱼精 DNA、 DTT 等分别 购自 Sigma 和华美生物工程公司.试剂的配制参照 有关文献[13] .

112 方法

11211 RT2PCR 总RNA 提取参照宝灵曼公司总 RNA 提取试剂盒进行 , cDNA 第一链的合成和 PCR 按分子克隆等方法进行[8 , 9] .步骤为 : (1) 新鲜膈肌

100 mg , 置1ml 总RNA 提取裂解液中 , 剪碎、 匀浆 ;

(2)

4 ℃ 离心

12 000 g *

10 min , 取上清 , 室温放置

1 ~3 min ;

(3) 加氯仿

012 ml , 用力振荡

15 s , 室温置 放反应

15 min ;

(4)

4 ℃ 离心

12 000 g *

10 min , 小心 取上层无色上清液至新的 EP 管中 , 加异戊醇

015 ml , 翻转混匀 , 室温放置 5~10 min ;

(5)

4 ℃ 离心

12 000 g *

10 min , 弃上清 , 加75 %乙醇

1 ml , 滚动 EP 管漂洗 RNA 沉淀 ;

(6)

4 ℃ 离心

7 500 g *

5 min , 弃上 清,室温干燥 5~10 min , 加50μ l DEPC 处理过的去 离子双蒸水 , 55~60 ℃水浴孵化 10~15 min ;

(7) UV22201 型紫外分光光度计测总 RNA 浓度 , 重复测 定3次,取均值为测量值.按下式计算总 RNA 浓度:总RNA 浓度( μ g/ ml) = A260 * 稀释倍数 * 40.

11212 cDNA 第一链的合成 取总 RNA 溶液

1 μ g , 于冰上加以下试剂 : (1) 1μ l Oligo DT15 , DEPC 水加至 10μ l , 轻轻混匀........