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1 kDa 乳铁蛋白肽,试验调整分离胶中聚丙烯酰胺浓度及凝胶的交联度,并加入适量甘油,改进了传统的 Tricine-SDS-PAGE方法.结果表明,该方法与常规的SDS-PAGE 和Tricine-SDS-PAGE 相比较,改进的凝胶不仅可以有效分离3.1 kDa的肽,而且对分子量为212 kDa的大分子量蛋白也有很好的分离效果,明显优于常规的SDS-PAGE和现有的Tricine-SDS-PAGE方法. 关键词 牛乳铁蛋白肽;

Tricine-SDS-PAGE;

小分子肽;

大分子量蛋白 中图分类号 S816.79 Analysis of recombined Lactoferricin B by Tricine-SDS-PAGE Xing Fangfang, Huang Ruilin, Zhang Youming, Li Tiejun, Yin Yulong Abstract In order to separate 3.1 kDa Lactoferricin B,we improved the traditional method of Tricine-SDS-PAGE. In this improved procedure, we adjusted the acrylamide concentration and the degree of crosslinking on the resolution of proteins and added proper Glycerol to separate the low molecular weight peptides. Compared with the methods of familiar SDS- PAGE and Tricine-SDS-PAGE, the improved gel have better effects not only on separating the 3.1 kDa peptides but also on

212 kDa high molecular weight proteins. Key words Lactoferricin B;

Tricine-SDS-PAGE;

low molecular weight peptide;

high molecular weight protein 牛乳铁蛋白肽(Lactoferricin B,简写为Lfcin B)是从牛乳铁蛋白的N-端(17~41)被胃蛋白酶水解下来的25个氨基酸残基, 其氨基酸 顺序为:Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe,分子量 为3.1 kDa. Lfcin B与牛乳铁蛋白的功能密切相关,是牛乳铁蛋白的活性中心,除不能结合铁离子外,Lfcin B具有抗菌、抗病毒、抗氧化,调节机 体免疫和提高肠道对铁离子吸收等作用.Lfcin B具有广谱抗菌活性,对革兰氏阴性和阳性病原菌均有抑制作用,与牛乳铁蛋白相比, Lfcin B的抗菌活性提高了400多倍. 因为Lfcin B来源于动物本身,不含稀有氨基酸和外源化学成分,是一种健康、安全的活性物质,不使细菌产生抗药性,也不会在畜产 品中残留,具有传统抗生素没有的作用效果,加之其物化性质和生物学活性独特,自然引起了研究者的关注.基因工程技术的应用能 有效提高Lfcin B的产量,具有广阔的应用前景.国内外学者已经克隆了人、牛和猪的LF(乳铁蛋白)基因,并在细菌、曲霉、烟草、 酵母和乳腺细胞中表达,而且正在开展其表达产物在医学和动物营养中的应用研究.本试验通过对重组Lfcin B的研究建立一套可同时 分离小分子肽与大分子量蛋白的Tricine-SDS-PAGE方法.

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂 Tricine购自Merck公司,聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂及蛋白质分子量标准品(2~212 kDa)均为New England Biolabs(Beijing)Ltd产品, 蛋白质分子量标准品(M)含有

212、

158、

116、

97、

66、

56、

43、

36、

27、

20、

14、

7、2 kDa共13种成分.巯基乙醇(Sigma, USA)、过硫酸铵(APS)(Sigma,USA)、TEMED(Sigma,USA)、丙烯酰胺(Sigma,USA)、甲叉双丙烯酰胺(Sigma USA),Tris碱、 SDS等试剂为国产分析纯. 1.1.2 仪器 蛋白质微量电泳仪(Bio-Rad Lab,USA)、MiniproteinⅡ垂直电泳槽(Bio-rad Lab,USA)、凝胶成像仪(Bio-rad)等. 1.1.3 电泳溶液配制 ① 49.5% T 3%C:丙烯酰胺(Acrylamide)48 g,双丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)1.5 g,加ddH2O溶解,定容到100 ml. ② 49.5% T 6%C:丙烯酰胺(Acrylamide)46.5 g,双丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)3.0 g,加ddH2O溶解,定容到100 ml. ③ 凝胶缓冲液:Tris.HCl/SDS pH值8.45,Tris.HCl

182 g,ddH2O

300 ml,用HCl调pH值8.45,补足ddH2O到500 ml,加SDS 1.5 g. ④ 阳极缓冲液:Tris.HCl 121.1 g,ddH2O

400 ml,用HCl调pH值8.9,补足ddH2O到500 ml. ⑤ 阴极缓冲液:Tris.HCl 12.11 g,Tricine 17.92 g,SDS

1 g,加ddH2O溶解,定容到1

000 ml. ⑥ 10%过硫酸铵溶液:称取1 g过硫酸铵溶于10 ml的双蒸水中. ⑦ 二硫苏糖醇(DTT)(10 μg/l):先配制0.5 mol/l DTT母液,4 ℃避光保存,使用时每500 ml ddH2O中加10 μl DTT母液. ⑧ 银染液(0.1%,w/v):称取AgNO3 0.5 g溶于500 ml ddH2O. ⑨ 显影液:先称取15 g无水Na2CO3溶于500 ml ddH2O中,临用前加250 μl 37%(w/v)甲醛,制成完全显影液. 1.1.4 样品处理液及样品制备 样品处理液由4%SDS、12%甘油(w/v)、50 mmol/l Tris、2%β-巯基乙醇(v/v)、0.01%溴酚蓝组成,调pH=6.8,室温存放. 转牛乳铁蛋白肽基因的工程菌(BL21)由本实验室与德国Gene Bridges公司张友明博士合作构建.首先准备2支试管,每支加入LB (含氯霉素50 μg/ml)液体培养基3 ml,然后在每支试管中加入从-70 ℃冰箱中取出的工程菌10 μl,置于37 ℃恒温培养箱中,震荡 培养过夜.在两个锥形瓶中分别加入50 ml LB(含氯霉素

50 μg/ml)液体培养基,然后接入培养过夜的工程菌2 ml,置于37 ℃培养 箱震荡培养.1 h后,每20 min测一次OD值,当OD值达到0.5左右停止培养.其中一瓶加诱导剂IPTG(3 mmol/l)37 ℃诱导.诱导后 的表达菌液12

000 r/min离心1~2 min,弃上清液.沉淀中加入10 ml蒸馏水悬起,进行冰浴超声,超声3 s/off,4 s/on,50循环, 然后取100 μl样品,加入50 μl样品处理液,沸水浴5 min,此为全菌样品.另一瓶未诱导的菌液进行同样处理作对照,剩余样品于-20 ℃冰冻保存备用. 1.1.5 凝胶的制备 参照Schagger等[7]的方法进行,凝胶制作采用三层不连续胶系统,电泳装置为Mini-protean Ⅱ型电泳仪(Bio-rad产品),板胶厚1.5 mm.分离胶浓度为20%,夹层胶浓度为10%,浓缩胶浓度为4%. 先灌下边的致密胶和夹层胶,然后铺水层,可以避免断层问题,待胶凝固后,除去水层,灌上面的浓缩胶,小心插入梳子,静置.凝 胶组成见表1. 1.2 点样与电泳 采用不连续缓冲系统,在内槽加入负极电泳缓冲液,外槽加入正极电泳缓冲液,用微量注射器小心吸取10 μl处理好的乳铁蛋白肽样 品,加入点样孔.开始时电压为50 v,待样品完全到达分离胶与夹层胶界面后,120 v恒压电泳至结束.电泳后,用考马斯亮蓝染色法 和银染法处理凝胶. 1.3 牛乳铁蛋白肽表达检测 为了进一步证明牛乳铁蛋白肽在工程菌中获得表达,利用牛乳铁蛋白肽的抗菌作用进行体外抑菌试验.分别取加IPTG诱导表达后的全 菌样品与未加诱导剂诱导表达的全菌样品100 μl,加到处于接入大肠杆菌DH5α的LB液体培养基中,37 ℃恒温振荡培养,5 h后观察 DH5α的生长状况.然后通过对凝胶进行双波长扫描,明确目的蛋白的表达量.

2 结果 2.1 牛乳铁蛋白肽电泳结果 牛乳铁蛋白肽经20%Tricine-SDS-PAGE之后,采用银染方法,显色后可分离出13条以上蛋白区带,分子量在2~212 kDa之间,若采用考 马斯亮蓝染色法进行,由于乳铁蛋白肽分子量较小及其自身结构特点,在染色与脱色过程中极易从凝胶中渗出,显色后的蛋白条带分 辨率不高,如图1所示,多呈弥散状.因此,经过多次试验,选用灵敏度较高、速度较快的银染法进行染色,结果如图2所示. 2.2 乳铁蛋白肽表达检测 利用工程菌全菌蛋白进行抗菌活性检测,结果如图3所示,加入诱导表达全菌蛋白的菌液相对澄清,说明加入的蛋白混合物中含有抗菌 物质;

而加入未诱导表达全菌蛋白的菌液相对混浊,细菌长势良好,说明IPTG诱导表达产物为乳铁蛋白肽.进而对目的蛋白进行半定 量检测,凝胶双波长扫描结果表明,目的蛋白质质量分数占细菌全菌蛋白约21%,乳铁蛋白肽基因获得高效表达.

3 讨论 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是分离蛋白质的常用生化方法,样品的蛋白质分子热变性解聚后与SDS结合形成带负电的蛋白质- SDS复合物,复合物在电泳中的迁移率取决于蛋白质的分子大小.使用均匀浓度的SDS-PAGE来分析分子量在15~200 kDa的蛋白质 时,蛋白质对数分子量和迁移率呈直线关系,因此对于分子量小于10 kDa的蛋白质,只能根据标准分子量进行估计,推断其是否落入 预测的分子量范围. 在蛋白质的生化分析和基因表达产物的分离纯化中,难免会需要分离某种小分子蛋白.小分子多肽的SDS-PAGE在蛋白质酶解产物和 一些疾病的分析方面具有重要作用.目前,用于分离小分子多肽的SDS-PAGE方法大多数采用梯度凝胶和高浓度的尿素体系,制作较 麻烦, 而且需要专门的灌胶设备. Schagger等报道了一种改进的Laemmli法,用Tricine-SDS-PAGE方法慢离子电泳来分析小分子肽,改用Tricine-SDS-PAGE系统后, 对小分子肽的分辨率明显提高.用Tris-tricine体系代替Tris-glycine体系后可很好地分离分子量在1~100 kDa的蛋白质,该方法避免 了繁琐地制备梯度胶和使用高浓度尿素,按照 小孔胶+夹层胶+浓缩胶 模式制作不连续的梯度胶,制作方法相对简单,目前已经广 泛用于分析小分子量蛋白.但本方法对大分子成分的分离没有明显优势,而且分离的范围较窄,对于检测分子量大小不一的蛋白混合 物来说,存在很大难度. 电泳缓冲系统是影响电泳结果的重要因素,本实验所用的阴阳极缓冲液pH 值及组成不同,电泳过程中阴阳极缓冲液pH值会趋向一致, 所以每次电泳最好使用新鲜的电泳缓冲液(最多可重复使用一次).阴极缓冲液所使用的Tricine价格昂贵,每次电泳更换阴极缓冲液 成本较高,实验过程中,用Tricine将使用过的阴极缓冲液调至pH值8.25,阴极缓冲液可以重复使用多次且有较好的重现性.此外,由 于超低分子量多肽(分子量3 000及3 000以下)极易从凝胶上浸出,因此染色及脱色时间不宜太长,脱色后凝胶液不宜在水中浸泡保 存过久,否则条带会消失.通过与考马斯亮蓝染色法比较,选用效果较好的银染法,可简单、快速地达到染色效果. 本试验采用改进的Tricine-SDS-PAGE方法分析工程菌的表达产物,操作简便,不需要对样品进行纯化、浓缩等处理,可用样品处理液 处理后直接加样,样品用量少,分辨率高.试验结果表明,采用改进后的Tricine-SDS-PAGE法不仅可以使小分子量的3.1 kDa牛乳铁 蛋白肽得到较好的分离,而且通过调节凝胶浓度,也使大分子量蛋白得到了很好的分离,分离范围比较宽,大约2~212 kDa.因此, 该方法所用体系对于检测难分离的分子量大小不一的蛋白混合物有显著优势. 随着分子生物学和生物技术的迅速发展,生物活性多肽物质的发现和多肽类生物功能的分析研究越来越受到人们的重视,小分子多肽的 电泳分析技术变得越来越重要,已成为生物活性物质纯化分析过程中不可缺少的、经常使用的快速鉴定方法之一.此外,由于该电泳系 统内没有尿素和甘氨酸,不会影响蛋白质氨基酸序列的测定,因此可广泛用于蛋白分析. 参考文献

1 Bellamy W, Takase M, Yamaudhim K, et al. Identification of the bactericidal domain of lac........