PDF《ExpressPlus 预制胶 》

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ExpressPlusTM 预制胶? ? ? ? 技术手册No.

?TM?0645? 版本20140116? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 仅供研究使用,不得用于动物及人类的治疗或诊断? ? ? 1? ? 目录? ? I? ? 简介.2? ? II? ? 凝胶选择指导…3? ? III? ? 兼容的电泳槽…5? ? IV? ? ExpressPlusTM ? 预制胶使用简介…5? ? V?凝胶染色…12? VI? ? 蛋白转移…13? VII? ? ExpressPlusTM ? 预制胶性能…14? VIII?故障诊断…14? IX? ? 相关产品和订单信息…16? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2? ? I. 简介? 金斯瑞? ExpressPlusTM 预制胶是一款高性能的小型聚丙烯酰胺凝胶, 能满足客户上样量大的 需求.其独特的胶板设计可以提高条带分辨率,改善样品在上样孔里的分布状态,使得条带更 加均匀.该预制胶为BisTris凝胶缓冲系统,比常规的TrisGlycine系统具有更强的缓冲能力,于pH6.4的弱酸性条件下灌注,能够更好地减少聚丙烯酰胺的降解,提高凝胶稳定性.? ? ExpressPlusTM 预制胶不含有SDS,依赖于采用合适的电泳缓冲液和相应试剂,是SDSPAGE 和非变性凝胶电泳的理想材料. 依赖特有的灌注技术可以保证预制胶批次间稳定性和条带分布 一致性.ExpressPlusTM 预制胶配套使用TrisMOPS或TrisMES电泳缓冲液,能够实现高效、可靠 地分离蛋白质,便于后续染色或转膜检测.? ExpressPlusTM 预制胶提供不同浓度的梯度胶和固定浓度胶.梯度胶的浓度包括420%、 412%和816%;

固定浓度胶包括8%、10%和12%.每种浓度的预制胶都有10个点样孔、12个点 样孔和15个点样孔三种规格.胶板尺寸:长*宽*高为100?*?80?*4.7?mm;

凝胶尺寸:长*宽*厚为80*70*1?mm.? ? ? ? ? 主要特点:? ? ? ? 上样量大? ―? 最大上样量可达80?μl,? 高于其他公司同类产品? ? 简单易用? ―? 特殊上样口设计,使用普通10?μl移液枪头快速上样? ? 高分辨率? ―? 蛋白条带分离更为清晰和均一? ? 超长保质期? ―28℃可保存12个月? ? 兼容性胶板设计? ―? 适合大多数小型电泳槽? ? 重复性高? ―不同批次预制胶的一致性好? ? 物美价廉? ―? 节约实验成本? ? ? ? ? ? 3? ? II. 凝胶选择指导手册? ? ? 表1. 凝胶选择指导 产品编号? ? 丙烯酰胺浓度? 孔数? 上样孔体积? 电泳缓冲液? 转移缓冲液? 分离范围? M00810? 8% ? 10? 80?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 180D20?kDa? M01010? 10%? 10? 80?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 160D20?kDa? M01210? 12%? 10? 80?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 120D6.5?kDa M42010? 420%? 10? 80?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 250D10?kDa? M81610? 816%? 10? 80?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 160D10?kDa? M41210? 412%? 10? 80?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 250D20?kDa? M00812? 8% ? 12? 60?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 180D20?kDa? M01012? 10%? 12? 60?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 160D20?kDa? M01212? 12%? 12? 60?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 120D6.5?kDa M42012? 420%? 12? 60?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 250D10?kDa? M81612? 816%? 12? 60?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 160D10?kDa? M41212? 412%? 12? 60?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 250D20?kDa? M00815? ? ? 8%? ? 15? 40?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 180D20?kDa? M01115? 10%? 15? 40?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 160D20?kDa? M01215? 12%? 15? 40?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 120D6.5?kDa M42015? 420%? 15? 40?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 250D10?kDa? M81615? 816%? 15? 40?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 160D10?kDa? M41215? 412%? 15? 40?μl? MOPS,?MES? TrisBicine? 250D20?kDa? ? ? ? ? ? ? 4? ? 下图的蛋白迁移表可以帮助您选择合适的凝胶进行蛋白电泳? ? 表2.? 蛋白电泳迁移表? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5? ? III. 可兼容电泳槽? ? ExpressPlusTM 预制胶可兼容以下电泳槽:? BioRad?MiniPROTEAN? ?II?&

?3? BioRad?MiniPROTEAN?? ?Tetra?System? LONZA?PAGEr? ?Minigel?Chamber? Hoefer?Mighty?Small?(SE?260/SE?250)? ? Hoefer?Tall?Mighty?Small?(SE?280)? Invitrogen?Novex?XCell?I,?II?&

?Surelock?? (Invitrogen电泳槽须与金斯瑞特供的挡板一起使 用)? ? ? IV. ExpressPlusTM 预制胶的使用方法? ? A. 电泳缓冲液和电泳槽的准备? 1. 取一包电泳缓冲液粉末(MOPS?Running?Buffer?Powder, 目录号: M00138)? 溶解在 1?L 的去离 子水中制成 1*电泳缓冲液.? 2. 将ExpressPlusTM 预制胶从包装袋中取出,撕掉胶板底部的胶带(见图 1).? ? 图1.? 撕下胶板底部胶带? ? ? 6? ? 3. 平稳地将梳子从胶板中推出(见图 2).? ? ? ? 图2.? 将梳子从胶板中推出? ? 4. 将胶板放入凝胶电泳装置中.? 请参阅电泳装置制造商的使用说明.? ? BioRad?MiniPROTEAN? ?Tetra?System电泳槽的使用注意事项:? 将电泳槽内框架的绿色硅橡胶密 封条取出,然后将其平坦的一面朝外并重新插回内框架的凹槽中(见图3).? ? ? ? 图3.?ExpressPlusTM ? 预制胶在BioRad?MiniPROTEAN? ?Tetra?System电泳槽中的使用? ? Invitrogen?Novex?MiniCell 电泳槽的使用注意事项: 使用? Invitrogen?Novex?MiniCell 电泳槽时必 ? 7? ? 须配套使用产品包装中所提供的适配塑料挡板.当使用一片胶进行电泳时,需在该片胶的外侧 增加一片金斯瑞提供的挡板,插入电泳槽中以补足厚度差,电泳槽另一边仍需插入 Invitrogen? 提供的挡板;

当使用两片胶进行电泳时,需在两片胶的外侧各自增加一片金斯瑞提供的挡板, 插入电泳槽中以补足厚度差(见图 4). ? ? ? ? 图4.?ExpressPlusTM 预制胶在 Invitrogen?Novex?MiniCell 电泳槽中的使用? ? 5. 在电泳槽的内槽中倒入足够的 1*?MOPS 或MES 电泳缓冲液使其覆盖上样孔 57?mm,在 外槽中加入相同的电泳缓冲液以确保适当的冷却.为了获得最好的效果,外槽的缓冲液 需要加到与内槽持平的位置或稍低,但不可漫过胶板(注意:1.? 相对于 MOPS 电泳缓冲 ? 8? ? 液来说,MES 更适合用于小蛋白的分离;

2.TrisGlycine 电泳缓冲液与 ExpressPlusTM 预制 胶的 BisTris 缓冲系统不兼容,请不要使用.)? 6. 使用注射器或其他工具吸取适量 1*的电泳缓冲液,将上样孔轻轻冲洗干净,去除气泡和 残留的储存缓冲液.? ? ? B. 样品的制备? ? ? 1. SDSPAGE凝胶电泳? ? 5*?Loading?Buffer配方:? SDS?1.0?g? 甘油?5.0?ml? 溴酚蓝?25?mg? Tris?Base?150?mg? β巯基乙醇?1.0?ml? 加去离子水至?10?ml? (用8?M?NaOH或8?M?HCl调pH至6.8)? ? 1*?MES电泳缓冲液配方:? Tris?Base?6.06?g? MES?9.76?g? SDS?1?g? EDTA?0.3?g? 加去离子水至?1000?ml (用8?M?NaOH或8?M?HCl调pH至7.3)? ? 9? ? 10*?MOPS电泳缓冲液配方:? Tris?Base?60.6?g? MOPS?104.6?g? SDS?10.0?g? EDTA?3.0?g? 加去离子水至?1000?ml? ? 样品处理? :? 蛋白样品?x?μl? Loading?Buffer?(5*2?μl? 加去离子水至?10?μl? ? 样品在上样前用70℃加热10分钟.? ? 2. 非变性PAGE凝胶电泳? ? ? ExpressPlusTM 预制胶中不含SDS,可用于非变性电泳.蛋白质样品需使用非还原性 和非变性的样品缓冲液制备,以保持蛋白质的二级结构和原生电荷.蛋白质的迁移率取 决于蛋白质的大小、空间结构以及它的净电荷.ExpressPlusTM 预制胶为pH6.4,进行非变 性电泳时需注意蛋白样品的酸碱性, 同时, 非变性电泳时间通常比SDSPAGE电泳时间长. ? ? 5*?Loading?Buffer配方:? 甘油?5.0?ml? 溴酚蓝?25?mg? Tris?Base?150?mg 加去离子水至?10?ml? (用8?M?NaOH或8?M?HCl调pH至6.8) 1*?MES电泳缓冲液配方:? ? 10? ? Tris?Base?6.06?g? MES?9.76?g? EDTA?0.3?g? 加去离子水至?1000?ml (用8?M?NaOH或8?M?HCl调pH至7.3)? ? ? 10*?MOPS电泳缓冲液配方:? Tris?Base?60.6?g? MOPS?104.6?g? EDTA?3.0?g? 加去离子水至?1000?ml? ? 注意事项:金斯瑞提供的电泳缓冲液粉末(MOPS?Running?Buffer?Powder,目录号: M00138)含有SDS,所以不适合非变性电泳.? ? 样品处理? :? 样品?x?μl? Loading?Buffer?(5*2?μl? 加去离子水至?10?μl? ? 不要加热样品.? ? 3. 电泳过程? 蛋白质样品上样? 让上样枪头的尖端垂直插入到上样孔中能够获得最佳的上样效果,枪头不能戳破胶体, 更不能使胶板变形导致样品漏孔(见图5) .? ? ? 11? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 图5.? 上样方法? ? 注意事项:最佳上样量必须通过实验来确定,样品过量会导致条带的拖尾和失真.加入过量的 含自由状态碳水化合物的蛋白,可能会导致条带变形或者蛋白无法穿入胶中(见故障诊断) .? 将电泳槽盖子盖好,并将电源线插头插入电泳仪电源插孔(红对红,黑对黑) ,在140V电压下 电泳4555分钟直至溴酚蓝条带跑到凝胶底部(见表3) .? ? 表3.? 一块ExpressPlusTM 预制胶的电泳参数? ? 重要注意事项:? 确保使用兼容的电泳槽,内外槽之间液体的泄漏会导致低迁移率(见故障诊断) .? 电泳时间可能会改变,取决于电源和凝胶浓度.? ? 4. 从胶板中取出凝胶(见图6)? ? ? 1) 电泳结束后,根据电泳槽制造商的使用说明从电泳槽中取出预制胶.? 2) 通过撬具或其他合适的工具小心的插入到胶板之间的空隙.? 3) 用撬具慢慢地上下撬动胶板,重复上述操作,撬动上、中、下三个不同的位置,直至胶 板两侧被完全分开.注意小心并最好佩戴护目镜,以免发生人身伤害.? 电压? 开始电流? 结束电流? 电泳时间*? 140?V? ? 75100?mA? 3050?mA? ? 4555? 分钟? ? *凝胶的电泳时间取决于实验室的温度,这些电泳时间是依据实验室中20℃的MOPS、MES缓冲液得来的? ? 12? ? 4) 打开之后,凝胶可能粘在胶板的任意一侧,将无凝胶的胶板取下,将有凝胶的胶板上有 胶一侧浸入水中贴着水面,胶板倾斜轻轻提起,凝胶掉入水中后,将凝胶从水中取出进 行染色(使用后的胶板和梳子请以医疗垃圾或实验废弃物处置,不可投入生活垃圾桶 中). ? ? ? 图6.? 打开胶板取出凝胶? C. 储存? ? ExpressPlusTM ? 预制胶储存温度为225?o C,如果28?o C保存,可保存12个月.? ? V. 凝胶染色? 所有标准SDS染色流程均适用金斯瑞ExpressPlusTM? 预制胶.当使用市售染色剂和设备,请 参考说明书.? ? ? ? ? A.? 考马斯亮蓝? R250? 使用微波炉染色:? 1)?????配制染色液:在40%乙醇和10%醋酸溶液中溶解终浓度为0.1%(W/V)的考马斯亮 蓝R250.? 2)?????配制脱色液:将终浓度为10%(V/V)乙醇、7.5%(V/V)醋酸溶解在一起.? 3)?????电泳完成后,撬开胶板取出凝胶,然后放入装有100?ml染色液的染色容器中.? 4)?????盖上容器盖子并放入微波炉中用高热档位加热8分钟.为了避免危险,请注意不要 让溶液沸腾.? 5)?????从微波炉中取出染色容器,放在脱色摇床上常温轻摇5分钟.? ? 13? ? 6)?????倒掉染色液并用去离子水小心清洗凝胶.? 7)?????倒掉去离子水,并加入100?ml脱色液.? 8)?????盖上盖子,放入微波炉中用高热档位加热8分钟.? 9)?????倒掉脱色液,加入新的脱色液,重复步骤8.? 10)?从微波炉中取出,放在脱色摇床上常温轻轻震荡至背景清晰.? ? B.? 考马斯亮蓝? R250? 常规? 染色:? ? 1)?????配制染色液:在40%乙醇和10%醋酸溶液中溶解终浓度为0.1%(W/V)的考马斯亮 蓝R250.? 2)?????配制脱色液:将终浓度为10%(V/V)乙醇、7.5%(V/V)醋酸溶解在一起.? 3)?????电泳完成后,........