PDF《引物设计》

引物设计 严昊,张智慧,申梁,马兴杰 介绍 Primer5介绍 Oligo6介绍 引物设计的原则 上游引物和下游引物 ? 什么是上游引物,什么又是下游引物? 3'….

ATCCGCACGCACGCACAGAGC…..5' template 5'…TAGGCCG…3' Primer upstream 5'…TAGGCCGTGCGTGCGTGTCTCG….3' 3'……CAGAGC….5' primer downstream DNA聚合酶 只能从5'向3' 延伸 谁先延伸就是上游引物,后延伸的就是下游引物 参考值 ? 引物长度(primer length) ? 产物长度(product length) ? 序列Tm值(melting temperature) ? ΔG值(internal stability)、 ? 二聚体,发夹结构(Dimer and hairpin) ? 错误引发位点(false priming site) ? 引物及产物GC 含量(composition) ? 3'末端稳定性(3' End Stability) ? 引物的长度一般为15-30bp,常用的是18- 27bp. ? 因为过长会导致其延伸温度大于74℃,即Taq 酶的最适温度. Tm值与GC含量 ? GC含量大,Tm值大,解链温度高. ? 对于PCR反应来说GC含量在40%―60%,一般50%左右比 较合适. Tm值控制在50-70之间 ? 有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高,导致引物的GC含量 不能在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC 含量以 及Tm 值保持接近. ? 反映了引物与模板结合 的强弱程度 ? 一般情况下,引物的ΔG值最好 呈正弦曲线形状,即5'端和中间 ΔG值较高,而3'端ΔG值相对较 低,且不要超过9(ΔG值为负值, 这里取绝对值),如此则有利于 正确引发反应而可防止错误引发. ΔG值ΔG 3' -2 -6 -8 -10 产量100% 40% 20%

0 hairpin false priming site Dimer attention Dimer是引物之 间的配对,如果 配对区域在3 末 端问题会更为严 重,3 末端配对 很容易引起引物 二聚体扩增. 发卡结构的稳定性可以 用自由能衡量.自由能 大小取决于碱基配对释 放的能量以及折叠DNA 形成发卡环所需要的能 量,如果自由能值小于

0 则该结构可以干扰反 应. 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过 4.5 3'末端稳定性 ? 一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端.如果引物3 稳定性强,有可能在即使5 末端不配对的情 况下造成错配,形成非特异性扩增条带 (secondary bands) ? 引物3'端的序列要比5'端重要.引物3'端的碱 基一般不用A(3'端碱基序列最好是G、C、 CG、GC),因为A在错误引发位点的引发效 率相对比较高 补充:GC clamp ? GC钳?引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端.这一段有较强稳定性的5 末端称为GC 钳. 添加酶切位点 ? 1.上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的 识别序列 ? 2.酶切位点前加入保护碱基,大多数限制酶 对裸露的酶切位点不能切断. ? 3.保护碱基加入后要考虑是否形成新的酶切 位点. Primer

5 ? File new seq 点击ctrl+v将序列粘 贴上去 出现 点击search Second way 结果 Oligo介绍 ? 主要为对primer5设计出的引物进行更细致的评估. ? 得到两条引物,添加保护碱基,和酶切位点 ? Sense: ATCGAATTCATGGCGAAG ? Anti-sense GGAGGATCCAGTACGTTG 将设计好的引物放入oligo6内分析 file New sequence manual click 点击accept Edit Lower primer Accept and close analyze Upper primer dimer Lower primer dimer hairpin False priming site PCR Primer internal stability Composition and Tm 结语 ? 这章ppt 只是对引物设计的入门式讲解,希望为大 家起到一个抛砖引玉的效果 ? PPt没有包括degenerate primer的设计,但原理是 一致的,可以参考abc网站中的primer design ? 原理和工具就像是圣斗士的战衣,穿什么战衣不重 要,不要太过拘泥于这些条条框框,只要你能扩出 你要的片段,那么你就胜利了. 引用文献 ? General concepts for PCR primer design.C W Dieffenbach, T M Lowe, G S Dveksler,Volume: 3, Issue: 3, Publisher: Cold Spring Harbor Lab, Pages: S30-S37 ? Efficient primer design algorithms Thomas K?mpke1, Markus Kieninger2 and Michael Mecklenburg Bioinformatics (2001)