PDF《快速参考手册》

1 Ion PGM? Hi-Q? View OT2 试剂盒 Catalog Number A29900 Pub.

No. MAN0014580 Rev. C.0 注:有关安全性和生物危害指南,请参阅 Ion PGM? Hi- Q? View OT2 Kit User Guide (Pub. no. MAN0014579) 中 安全性 附录.请阅读安全性数据表(Safety Data Sheets (SDS))并遵循操作指导.操作时请穿戴合适的护目镜、 保护性的实验服及实验手套. 重要!如果您在 Ion OneTouch? Dx 系统上使用 Torrent Suite? Assay Development Software1 ,请参阅 Ion PGM? Hi-Q? View OT2 Kit on the OneTouch? Dx System in Assay Development Mode User Guide (Pub. No. MAN0015753) 运行 ION ONETOUCH?

2 仪器.1 配置 ION ONETOUCH?

2 仪器.1 开始运行

2 回收带模板的 ISPS.3 清洗 ION ONETOUCH?

2 仪器.3 富集带模板的 ION PGM? HI-Q? VIEW ISPS

4 运行 Ion OneTouch?

2 仪器 1. 关闭离心机盖,点击主屏幕上的 Run 按钮. 2. 点击下拉菜单,根据您的文库读长,选择 PGM: Ion PGM? Hi-Q? View OT2 Kit C 200, 或者 PGM: Ion PGM? Hi-Q? View OT2 Kit C 400, 然后点击 Next. 3. 点击 Assisted 并在屏幕提示下完成配置,或者点击 Expert 并根据以下指导完成仪器配置. 配置 Ion OneTouch?

2 仪器 安装 Ion OneTouch? 回收管和 Ion OneTouch? 回收搭 桥1. 在两个 Ion OneTouch? 回收管中各添加 150μL Ion OneTouch? Breaking Solution.

1 Ion OneTouch? Dx 系统使用的 Torrent Suite? Assay Development Software 仅限于科学研究,不用于临床诊断. 2. 将2个装有 Ion OneTouch? Breaking Solution 的回收 管装入离心机的相应位置. 3. 在离心机中央处装好回收搭桥. 4. 关上离心机盖. 安装 Ion OneTouch?扩增板 移除已使用过的清洗适配器,装入扩增反应板,拉动手柄以 合上热盖.将一次性胶管穿过胶管阀. 注意!表面灼热.在此区域附近工作时请小心不要 被灼热的部件烫伤. 警告!安全危害.请不要将易燃易爆物品用于本仪 器.为确保安全,请仅选用本仪器专用试剂耗材. 注意!身体伤害危害.一次性针头的末端可能会刺 破您的皮肤.请勿用手触碰一次性针头末端. 安装一次性针头 插入一次性针头,然后通过按压-释放注射针头插孔来确认一 次性针头在回收搭桥上已自动固定到正确位置. 您应该能听到一声 咔嗒 . 安装试剂管 1. 在仪器左前方标记 处添加 Ion One Touch? Oil. 颠倒混匀 Ion One Touch? Oil 试剂瓶(450 mL 试剂瓶) 三次.然后向试剂管中注入 Oil 至半满,将试剂管安装 回原处.尽量减少气泡. 2. 在仪器右前方标记 处添加 Ion One Touch? Recovery Solution.颠倒混匀 Recovery Solution 试剂 瓶三次,然后向试剂管中注入约 1/4 体积的 Recovery Solution.将试剂管安装回原处.尽量减少气泡. 重要!确认仪器已更新最新版固件配置.更新固件的方 法请参阅 Ion OneTouch?

2 System User Guide(Pub. No. MAN0014388)中的详细介绍. 快速参考手册

2 清空废液缸 合理处置废液. 准备扩增反应液 1. 准备如下试剂: 试剂 准备 Ion PGM? Hi- Q? Reagent Mix 1. 使用前使试剂恢复至室温. 2. 涡旋震荡 30s,瞬离 2s. 3. 使用时将试剂放置在室温. 溶解后未用的试剂请保存在 2-8°C. Ion PGM? Hi- Q? Enzyme Mix 用前瞬离 2s,放置在冰上待用. Ion PGM? Hi- Q? ISP 使用前放置在室温待用. 2. 根据您的文库类型和浓度,按照下表稀释文库.稀释后 的文库请在

48 小时内使用. Ion Ampliseq? DNA 文库 Ion Ampliseq? RNA 文库 gDNA 片段化文 库或扩增 子文库 Ion Total RNA- Seq 文库文库浓度100 pM

100 pM

100 pM

100 pM 文库体积2μL

4 μL 6.5 μL

5 μL 无核酶水23 μL

21 μL 18.5 μL

20 μL 总体积25 μL

25 μL

25 μL

25 μL a. 涡旋震荡稀释后的文库 5s,然后瞬离 2s. b. 将稀释后的文库放置在冰上待用. 3. 准备 Ion PGM? Hi-Q? View ISPs: a. 最大速度涡旋震荡 ISPs 1min 以充分重悬 ISP 微珠. b. 将ISPs 瞬离 2s. c. 用移液器反复吹吸混匀 ISPs. d. 立即进行下一步操作. 4. 在含有

800 μL Ion PGM? Hi-Q? View Reagent Mix 的2mL 管(紫盖)中,按指定顺序加入以下组分.每加入 一种组分后,使用移液器吹吸混匀扩增反应液. 顺序 试剂 管盖颜色 体积

1 无核酶水 ―

25 μL

2 Ion PGM? Hi- Q? View Enzyme Mix 棕色

50 μL

3 稀释后的文库(不 是文库保存液) ―

25 μL

4 Ion PGM? Hi- Q? View ISPs 黑色

100 μL ― 总体积 ―

1000 μL 重要!如果您是进行没有参考序列的 de novo 测序, 请向扩增反应液中加入

10 μL Ion PGM? Calibration Standard (Cat. No. A27832),并将无核酶水的体积 降至

15 μL.并在 Torrent Browser 中创建测序计划 时,在Kits 标签页的 Base Calibration Mode 下拉 菜单中选择 Enable Calibration Standard. 5. 将第

4 步中准备好的全部扩增反应液使用最大转速涡旋 震荡 5s. 立即进行 填充并安装 Ion OneTouch? Reaction Filter 填充并安装 Ion OneTouch? Reaction Filter 重要!我们推荐您在 PCR 扩增前制备区或者可控的 PCR 反 应制备通风橱中完成反应过滤器填充.请不要混用其他模板 制备试剂盒中的反应过滤器(reaction filter). 1. 用移液器吸取

1000 μL 制备好的扩增反应液,从加样孔 加入 Ion OneTouch? Reaction Filter. 2. 用移液器吸取

850 μL Ion OneTouch? Reaction Oil (25mL 试剂瓶),从加样孔加入 Ion OneTouch? Reaction Filter. 3. 更换移液器吸头并再次从加样孔加入

850 μL Ion OneTouch? Reaction Oil. 4. 翻转 Reaction Filter 并将其完全安装到 Ion OneTouch?

2 仪器顶部三孔的对应位置. 开始运行 1. 安装好 Ion OneTouch? Reaction Filter 后,点击 Next 以开始程序运行. 重要!请确认开始运行前在每个回收管内加入

150 μL Ion OneTouch? Breaking Solution.当屏幕上 出现提醒时,确认此项并点击 Yes.

3 注:如果您想放弃本次运行,点击 Abort,然后点击 Yes. 2. 请在开始运行后 16h 内从仪器上取下样本.在运行结束 后的屏幕提示行点击 Next 将直接进入 回收带模板的 ISPs 步骤. 回收带模板的 ISPs 1. 运行结束时,按屏幕提示对样本离心. 重要!如果您在 Ion OneTouch?

2 Instrument 仪器 对样本离心前取下了样本,或者在离心后 15min 内 没有处理样本,请在仪器上离心样本.在仪器主屏 幕上,点击 Open Lid,然后点击 Final Spin,根据 屏幕提示对样本进行离心. 注意!转动伤害.请等待离心机停止转动后 再打开盖子.转动的部分会导致受伤. 2. 待离心机停止后,在仪器的显示屏上,点击 Open Lid. 等待离心机盖子弹开,取下并扔掉 Ion OneTouch? 回 收搭桥. 3. 从仪器上取下两个 Ion OneTouch?回收管并放置在管 架上. 4. 从回收管中吸去上清,留下约

100 μL 回收液. 暂停点:向每一个回收管中加入

500 μL Ion OneTouch? Wash Solution 并反复吹吸以分散 ISPs.将悬浊液转移至标记好的新 1.5 mL Eppendorf LoBind? 离心管中.ISPs 可在 2-8°C 条 件下保存

3 天.富集前,15,500 X g 转速下将 ISPs 离心 2.5min.仔细的从回收管中吸去上清,留下约

100 μL 回收液.用一个新的移液吸头上下吹打以重 悬ISPs.进行第

6 步. 5. 处理 ISPs: a. 向每个回收管中加入

500 μL Ion OneTouch? Wash Solution. b. 反复吹打 ISPs 使其分散,然后将悬浊液转移至标记 好的新的 1.5 mL Eppendorf LoBind? 离心管. 注:如果有沉淀,50°C 孵育

2 分钟以使其溶解. c. 15,500 x g 将ISPs 离心 2.5min. d. 用移液器从管中吸去上清,留下

100 μL Wash Solution.请注意从液表面以及沉淀的对侧吸取上清. 6. 从Ion OneTouch? ES Supplies 试剂盒中取出一个

8 联管.确认

8 联管方形的一侧在左侧. 7. 反复吹吸 ISPs

10 次以混匀,然后将其转移至

8 联管的 孔1中. 8. 从孔

1 中分装部分未富集的 PGM? Hi-Q? View OT2 试剂液体用于质控.选择下列一种仪器对带模板的未富 集ISP 进行质控:Qubit? 2.0 或Qubit? 3.0 荧光计, Guava? easyCyte?

5 Flow Cytometer. 使用 Ion OneTouch? ES 富集带模板的 ISPs,您可以在 Ion OneTouch?

2 仪器进行清洗的时候进行该操作. 重要!不要在-30°C~-10°C 保........