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2 HER2 基因扩增检测试剂盒(荧光原位杂交法) 说明书 【产品名称】 通用名称:HER2 基因扩增检测试剂盒(荧光原位杂交法) 英文名称:FISH detection Kit for the amplification of HER2 gene 【包装规格】

10 人份/盒、20 人份/盒 【预期用途】 本产品用于检测福尔马林固定、石蜡包埋人乳腺癌组织样本 中的HER2基因扩增情况.

指导乳腺癌的治疗和预后评估,不用于 乳腺癌的筛查或诊断[1] . 【检测原理】 荧光原位杂交法(Fluorescent In Situ Hybridization,FISH) 能够使细胞中特定的核苷酸片段通过荧光而清楚的呈现,FISH 试 验过程中包含了双链 DNA 的解链,荧光标记的 DNA 探针能够与 目标序列结合[2-3] .杂交完成之后,多余的探针被清洗掉,同时, 细胞核被复染剂 4'

,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色会发出蓝色的 荧光.本试剂盒包含一组探针:HER2(红色)位点和 CEP17(绿色) 位点及 DAPI 复染液. 正常细胞信号方式: 每个细胞显示两个绿色信号及两个红色 信号. 异常细胞信号方式: 细胞中若出现三个及以上红色信号且绿 色信号不小于两个. 【主要组成成分】 试剂 规格 主要成分

10 人份

20 人份 HER2 /CEP17 探针 100μl 200μl 荧光标记探针 DAPI 0.5ml 0.5ml DAPI/抗褪色液、甘油 【储存条件及有效期】 HER2 /CEP17 探针及 DAPI 于-20℃避光、密封储存;

开封后,探针及 DAPI

24 小时内可在 2-8℃避光、密封储存;

24 小时内不能使用完的,请放置于-20℃± 3℃避光、密封储存;

自生产之日起有效期为一年. 【适用仪器】 本试剂盒探针杂交需在杂交仪上进行杂交,如ThermoBrite. 本试剂盒探针需在荧光显微镜下观察并分析结果.所需荧光 显微镜的配置包括: 物镜:在FISH 分析上,使用 100* 消色差浸油类型物镜可取 得满意效果. 镜油:在浸油式物镜上使用的镜油应为低水平自发荧光配方, 并专门在荧光显微镜上使用. 滤光片:建议客户处客使用探针前向滤片组供应商了解所使用 的滤片组的详细情况,以便选择与标记荧光染料相适应的滤片组. 绿色荧光:激发波长为 496nm,发散波长为 520nm 橘红色荧光:激发波长为 551nm,发散波长为 572nm 【样本要求】 福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌组织或细胞.样本应根据 实验室标准程序进行采集,试剂盒检验样本的选择应由病理学专业 人员执行.样本应避免与酸、强碱接触,并避免过热. 建议切片厚度不超过 4μm 左右. 【检验方法】

一、样本收集及玻片制备:

1、样本于常温下在10%中性福尔马林缓冲液中固定6~48小时,为 了达到最佳的和均匀的固定与石蜡包埋效果,样本大小不宜超过 0.5cm3 .

2、标准操作和石蜡包埋,使用高质量的石蜡.渗透和包埋应在低 于65℃下进行.

3、切成4μm厚度的切片.

4、切片捞于黏性玻片.

二、玻片预处理程序: 1. 56-65℃左右烤片三小时以上(过夜) . 2. 提前预热胃蛋白酶处理液,使其温度达到 37℃保温备用. 3. 二甲苯中室温放置切片

10 分钟,重复该步骤两次. 4. 100%乙醇中室温放置切片

5 分钟,重复该步骤一次. 5.依次 85%、70%乙醇中室温处理切片

3 分钟. 6.去离子水洗

2 分钟,重复

3 次. 7.用微波炉将适量的预处理缓冲液煮沸后, 然后使其处于保温状态, 放入切片修复 20mins,或是在高压锅内加入适量的预处理缓冲液, 高压修复 5min. . 8. 取出玻片, 用去离子水洗涤三次. 将切片直接放入蛋白酶消化液 中,消化 15± 10mins. 注: 根据不同的组织 (细胞) 类型及切片厚度, 消化时间有所不同, 一般来讲,建议预实验找到样本的最佳消化时间. 9. 去离子水清洗 2mins,三次. 10. 脱水: 70%, 85%, 100%乙醇溶液中依次处理各

2 分钟, 晾干. 三.FISH操作步骤 警告和预防:荧光基团遇强光会产生光漂白现象.将含有荧光基团的试剂与玻 片避光有助于减少此效应.所有需避光的步骤均在暗处进行. FISH 实验操作过程中请注意防护,试剂勿与皮肤直接接触.

(一)标本变性与杂交 1. 将含有的HER2/CEP17探针的杂交液从冰箱取出,瞬时离心,用 移液器取10μl至各个样本.滴加至目标区域;

2. 样本盖上盖玻片,避免气泡;

封片胶封片;

3. 将玻片放入杂交仪,80℃(± 2℃)变性6分钟,40℃过夜杂交. 注意:杂交期间片子不能干!

(二)杂交后的处理

1、提前30min将洗涤液I水浴加热到73± 1℃,小心除去封片胶;

2、将切片置于洗涤液II溶液中,放置5-10min,除去盖玻片;

3、将切片置于洗涤液I洗液(水浴加热到73± 1℃)中,上下提拉切 片1-3s,放置2mins;

4、室温条件下,将切片置于洗涤液II洗液中,上下提拉1-3s,处理 切片3mins;

5、在70%、85%的乙醇溶液中依次放置2mins. 6. 避光晾干样本. 注:考普林缸中每次最好同时放置4张切片,当最后一张玻片放入 考普林缸时开始计时.

(三)观察 1. 滴加10 μl DAPI复染液到切片组织上,盖上盖玻片,避免气泡, 暗处-20℃处理15分钟. 2. 于荧光显微镜下观察计数. 3.长期保存应放于-20℃.

五、 FISH检测结果分析 计数

30 个细胞,统计 Ratio 值(Ratio 值=30 个细胞核中红信 号总数/30 个细胞核中绿信号总数) . 常见异常类型:HER2 位点扩增.

1、正常细胞:单个间期细胞核中红色及绿色信号各

2 个.

2、 HER2 基因扩增异常细胞: 单个间期细胞核中红色信号大于 2,且绿色信号不少于

2 个. 结果分析注意事项:

1、样本需随机计数细胞.

2、计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞.

3、杂交不均匀的区域不要分析.

4、细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析.

5、背景深影响信号判断的区域不要分析.

6、计数结果需有两个参与人员独立完成,结果一致方可认定.

7、在分析石蜡切片时,分析的区域应在肿瘤细胞集中的部位(需 由病理科医师认定) .

8、如果超过 25%的细胞核内信号太弱,则该区域不要进行分析.

9、如果超过 10%的细胞质内有信号,则该区域不要进行分析. 【参考范围】 HER2/CEP17 探针包含

2 种DNA 探针, 在中期染色体与间期 核上均能杂交产生明亮的显微镜下肉眼可识别信号.HER2 DNA 探针杂交到人类

17 号染色体长臂 (17q11.2-q12) , 荧光信号为红色. 对照探针为CEP17 , 探针杂交信号 位于人类17 号 染色 体2/217p11.1-q11.1,覆盖整个着丝粒区域,荧光信号为绿色. 当HER2/CEP17 比值≥2.0 为阳性结果, 提示该样本 HER2 基因扩增;

当HER2/CEP17 比值........