PDF《MA C与LCزMS/MS技术分离和鉴定 化脓链球菌中的锌结合蛋白》

中国生物工程杂志 C h i n aB i o t e c h n o l o g y ,

2 0

1 1 ,

3 1 (

2 ) :

3 0 ?

3 7 利用 I MA C与LCMS / MS技术分离和鉴定 化脓链球菌中的锌结合蛋白 阳小燕 银兴峰 张留辉 贺翔孙雪松 ( 暨南大学生命与健康工程研究院 广州

5 1

0 6

3 2 ) 摘要 化脓链球菌是一种革兰氏阳性致病菌, 能引起一系列疾病.

运用固定化金属离子亲和层 析技术( I M A C ) 富集化脓链球菌中锌结合蛋白, 进行溶液酶解, 利用先进的 L C M S / M S技术对富 集的锌结合蛋白进行质谱分析.鉴定到

4 8个在化脓链球菌中与锌结合相关蛋白, 这些蛋白主要 涉及到蛋白翻译、 糖代谢、 金属转运、 氧化等重要生理过程.这些结果对于深入研究化脓链球菌 的致病机制, 寻找新的抗菌药物作用靶点和疫苗候选物具有重要意义. 关键词 L C M S / M S 化脓链球菌 锌结合蛋白 I M A C 中图分类号 Q

5 1

3 收稿日期:

2 0

1 0

1 0

1 9 修回日期:

2 0

1 0

1 1

2 4 共同第一作者 通讯作者, 电子信箱: t s u n x s @j n u . e d u . c n 化脓链球菌是一种革兰氏阳性致病菌, 能产生多 种毒素, 可引起急性风湿热、 咽炎、 脑膜炎、 脓疱病, 也 可引起严重的侵袭性感染如中毒性休克综合征、 坏死 性筋膜炎等, 对人类的健康造成重大威胁[

1

3 ] .在儿童 细菌性咽炎的病原菌中化脓链球菌列首位, 美国的研 究报道感染率约

1 5 % ~

3 0 % , 在成人咽炎中占

5 % ~

1 0 % [

4 ] , K i m等[

5 ] 报道

2 0

0 2年韩国门诊咽炎儿童化脓 链球菌培养阳性率高达

5 0 .

8 %.目前主要使用抗生素 来治疗由化脓链球菌引起的疾病, 近年来随着各种抗 生素在临床上的广泛使用以及不合理应用, 化脓性链 球菌的耐药率不断增加, 这一现况已受到医学界的广 泛关注和担忧, 因此寻找新的抑菌药物和疫苗候选物 成为目前研究的热点. 化脓链球菌对生长环境要求比较高, 其感染能力 与所处的宿主微环境紧密联系.环境因素中最重要的 因素之一就是金属离子浓度.一般来说, 低浓度金属 浓度促进细菌生长.但是达到一定的浓度时抑制细菌 生长[

6

7 ] .金属离子, 尤其是 Z n

2 + 、 M n 2+ 和Fe3+,是人 和细菌代谢过程中许多蛋白或酶的辅助因子, 为生存 所必需, 对于病原体的毒力和生理机制等方面有很重 要的影响[

8

9 ] .一些金属蛋白参与维持体内的金属内 稳态和解毒过程, 例如超氧化物歧化酶和铁蛋白[

1 0

1 1] ;

有一些金属酶类催化涉及核苷酸合成和新陈代谢等反 应.目前人们对金属离子的研究更多地集中在铁蛋白 和铜蛋白方面, 对锌相关蛋白的研究比较少.在生物 体中, 和锌相关的各类蛋白在生命体中担任着重要的 角色,有超过

3 0 0个酶或者蛋白需要 Z n

2 + 作为其辅助 因子来帮助发挥它们的功能[

1 2 ] , 很多研究都显示 Z n

2 + 对于病原体的毒力和生理机制等方面有很重要的影 响[

6 ,

9 ] .为了能全面地研究化脓链球菌中的锌结合蛋 白, 从而找到一些新的药物作用靶点或疫苗候选物, 本 研究采用 I M A C技术富集化脓链球菌中锌结合蛋白, 进 行溶液酶解, 利用具有灵敏、 快速、 高分辨率、 高质量准 确度等特点的 L T Qo r b i t r a p组合型傅立叶转换质谱仪 对得到的肽段进行质谱分析, 鉴定到

4 8个在化脓链球 菌中与锌结合相关的蛋白, 并对这些蛋白按功能以及 细胞定位进行分类, 构建它们的相互作用图.

1 材料与方法

1 .

1 菌株及培养 本实验采用化脓链球菌 M G A S

5 0

0 5菌株, 培养基 为含

0 .

5 %酵母浸出液的 T o d d H e w i t t 培养基( T H Y ) , 在37℃,

5 % C O

2 下培养细菌, 当细菌长到半对数期时 ( O D

6 0

0 =0 .

7 ) , 收集细菌.将样品低温离心(4℃,

5 0

0 0 r / m i n )

1 0 m i n , 去上清, 加入预冷的无菌 P B S , 低温

2 0

1 1 ,

3 1 (

2 ) 阳小燕 等:利用 I M A C与LCMS/MS技术分离和鉴定化脓链球菌中的锌结合蛋白 离心(

4 ℃,

5 0

0 0 r / m i n ) 洗涤 3次, 每次

1 0 m i n , 收集菌 体, 再将菌体转入干净的新 E p p e n d o f 管中存于 -

8 0 ℃ 备用.

1 .

2 试剂及仪器 试剂: 尿素、 硫尿、 C H A P S 、 二硫苏糖醇( D T T ) 、 碘 乙酰胺( I A A ) 、 蛋白酶抑制剂( P M S F ) 、 碳酸氢铵、 硫代 硫酸钠、铁氰化钾、 乙腈、 基质 α 氰基

4 羟基肉桂酸 ( C C A ) 、 三氟乙酸均为 S i g m a 公司产品, 胰蛋白酶购自 P r o m e g a 公司.I M A C试剂: 氯化锌、 磷酸二氢钠、 磷酸 氢二钠、 氯化钠、 尿素、 咪唑、 E D T A均购自 S i g m a 公司, I D A购自德国 T h e r m o 公司.核酶购自 G E公司.所有 试剂均用超纯水配置. L C M S / M S 质谱仪、 紫外分光光度仪和蛋白核酸干 燥仪均为德国 T h e r m o 公司产品;

C O

2 细胞培养箱为上 海一恒集团产品;

超声波细胞破碎仪为宁波新芝生物 仪器公司产品;

超净工作台为江苏苏净安泰公司产品;

核酸蛋白测定仪为美国 G E公司产品;

小型高速冷冻离 心机为德国 E p p e n d o r f 公司产品;

M I L L I P O R E纯水系统 为美国 M i l l i P o r e 公司产品.

1 .

3 蛋白质样品的制备 本实验采用反复冻融与超声裂解相结合的方法裂 解细菌.先加入一定量的裂解液( 含8mol/L尿素、

2 % m/ vN P

4 0 ,

2 % v / vI P G缓冲液( p H4~

7 ) 、

6 2 m m o l / L D T T和1%m/ vP M S F ) , 涡旋混匀.冰上放置, 每隔

2 m i n 涡旋

1 0 s , 充分震荡.然后放入液氮中,

1 0m i n后 取出放入

3 7 ℃恒温箱至解冻, 如此反复冻融 3次.将 样品超声

1 5 m i n , 其中冲击

5 s , 间歇

5 s .超声后, 加入

1 % v / v核酶,冰上放置30min,低 温离心10min(13200r/min),接着将上清即为总蛋白转入干净的新 E p p e n d o f 管中.用BrandF o r d法测定蛋白浓度, 然后将 样品分装后存于 -

8 0 ℃, 待用[

1 3 ] .

1 .

4 固定化金属离子亲和层析技术( I MA C ) 第一步用 P D

1 0脱盐柱对样品进行除盐, 具体步 骤为: (

1 ) 使用

2 5 m l B u f f e r A ( 含20mmol/Lp h o s p h a t e ,

3 m o l / L尿素) 洗涤柱子;

(

2 ) 将2.5m l 蛋白样品加入到 P D

1 0中;

(

3 ) 待2.5ml蛋白样品完成流出后, 向柱子中 加入3.5mlb u f f e rA ( 含7.80mmol/LNaH2PO

4、12.20mmol/LN a

2 H P O

4 、

0 .

5 0 m o l / L N a C l 、

3 m o l / L尿素) , 并收集

3 . 5m l 洗脱液.第二步制备 I D A Z n柱子, 首先将

1 m l 的固定化亚氨基二乙酸放入空柱子中, 静置1h后用 5m l 的超纯水冲洗柱体, 接着向柱子中加入 3m l

5 0 m m o l / L氯化锌, 用5m l 超纯水冲洗柱子以除去 未结合的 Z n 2+ .第三步将蛋白样品加入制备好的IDAZn柱子中, 首先用 5m l B i n d i n g B u f f e r 冲洗 I D A Z n 柱子除去未结合蛋白, 接下来用 5m l 含5mmol/L咪唑 的BindingB u f f e r 冲洗 I D A Z n柱去除非特异性结合蛋 白.最后用

3 . 5m l 含500mmol/L咪唑的 B i n d i n g B u f f e r 冲洗 I D A Z n 柱子, 此时收集的

3 . 5m l 的液体即为锌离 子结合蛋白样品, 用超滤柱浓缩蛋白样品至合适浓度.

1 .

5 溶液酶解 蛋白样品先用

1 0 m m o l / L的DTT还原(

3 7 ℃,

3 h ) , 接着用

2 0 m m o l / LI A A在室温下避光还原

1 h , 然后用

4 倍体积的预冷的丙酮沉淀蛋白

1 2h以上, 该步骤在 -

2 0 ℃下进行, 离心(

1 2

0 0

0 r / m o l ,

4 0 m i n ) 收集蛋白, 并用 1m l 乙醇洗涤沉淀, 重复 1次, 得到的 蛋白沉淀用50mmol/L的 碳酸氢铵溶解后, 加入胰蛋白酶酶解(37℃,4h) , 再重新加入相同体积的酶液酶解(

3 7 ℃ ,

1 6h ) , 得到的酶解片段用真空干燥机冻干,

2 0 ℃保存 待用[

1 4

1 5 ] .

1 .

6 质谱分析 冻干的酶解片段用溶解液( 含0.5%的 C A N ,

0 .

1 % 的甲酸) 溶解, 通过自动进样器上样到 T r a p柱上面脱 盐, 然后经过C18反 向柱(Michrom,Bioresources,Auburn,C A ) 分离并直接用质谱 L T Q O r b i t r a pX L检测.肽段在反相柱上的洗脱梯度是用 0~3

5 % A C N ( 含0.1%的甲酸) 洗脱

1 5 0m i n , 其流速为

2 5 0n l / m i n . 质谱主要参数和数据采集方法设置如下: i o nt r a n s f e r t u b e温度为

2 0

0 ℃;

e l e c t r o s p r a yv o l t a g e是1.85k V , 一 级质谱在 O r b i t r a p里扫描, 二级在 L T Q里用 C I D碰撞 模式完成[

1 5 ] .一级质谱扫描范围是

4 0 0~

2 0

0 0 D a , 二 级质谱中的标准化碰撞能量, 活化 q值 和活化时间分 别是

3 5 %,

0 .

2 5 ,

3 0m s.所有的原始数据文件用BioWo r k s

3 .

3 . 1( T h e r m oF i n n i g a n ,S a nJ o s e ,C A ) 进行 处理, 得到 p e a kl i s t 文件, 用SEQUEST软件检索 N C B I 中的化脓链球菌 M G A S

5 0

0 5数据库鉴定蛋白.

1 .

7 对锌结合蛋白进行分类和构建相互作用图 通过化脓链球菌 M G A S

5 0

0 5的GO数据库对鉴定 的锌结合蛋白按功能和细胞定位信息分别进行分类. 用STRING系统构建化脓链球菌与锌结合相关蛋白的 相互作用图[

1 6

1 7 ] .参数设置如下: 物种: 化脓链球菌;

可信 度:

0 .

4 0 ;

相互作用蛋白: 不超过10个.登录http://string.embl.de网站, 在数据库输入相关蛋白的 基因名, 自动生成蛋白质相互作用图.

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