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说明书人TNFa 单克隆抗体、其PEG 化纳米颗粒及其应用 技术领域 本发明涉及生物技术及医药领域, 具体涉及抗人 TNFa 单抗及其 PEG 化纳米颗粒及其应 用.

背景技术 自身免疫性疾病是继癌症和心血管疾病的第三大类疾病.类风湿性关节炎(RA)是最 常见的自身免疫病之一,我国类风湿关节炎患病率约为 0.32-0.36%,在60 岁以上人群发病 率高达 30%~40%.面对每人每年几十万元的进口药物治疗费用,患者往往只能长期忍受 痛苦的化学治疗,却又收效甚微. RA 的患病人群多,用药量大,使其治疗性药物的市场巨大,2005 年全球市场达到

60 亿美元.目前临床治疗 RA 的方案很多,首选用大剂量非甾体抗炎药可控制症状,如无效, 则临床首选氨甲蝶呤等免疫抑制药治疗.约四分之一的患者首次发病后经及时治疗可终生 不再复发,约二分之一的患者经治疗后症状暂时得以缓解,但仍会反复发作,部分最终发 展为关节功能障碍;

约四分之一的患者对目前所有的常规治疗均无效. 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是类风湿性关节炎病变过程中起主要作用的细胞因子,实 验和临床结果均证实 TNF 是治疗该病的适合靶点. 国外对 RA 的发病机理进行了充分的研究, 发现肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-?)在该疾病的病理进程中起十 分关键的作用,患者或动物模型病变关节腔内的 TNF 水平异常升高.TNF?和TNF?是哺乳动 物细胞中的一类同源分泌型蛋白质,它们相互之间具有很高的同源性,二者都可以对许多 细胞类型造成多方面的影响.这两种蛋白都可以通过与细胞膜上的受体作用而影响细胞的 生物学功能.肿瘤坏死因子 TNF?能够引起肿瘤组织出血坏死并具有多方面功能.成熟分子 由157 个氨基酸组成,含有两个二硫键,没有糖基化位点.其前体为

233 个氨基酸组成的 多肽,N-端76 个氨基酸组成的多肽不是信号肽,它可以把前体固定在细胞膜上,使成熟的 分泌型保留在细胞膜上.前体的成熟 mRNA 长度为 1.7kb.在体内主要由单核巨噬细胞产生. 针对 TNF-α的抑制剂成为迄今为止最为成功的 RA 治疗药物.代表药物如

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1 说明书Wyeth/Amgen 公司 Enbrel(etanercept),Johnson &

Johnson,Schering Plough/Centocor 公司 Remicade(infliximab), Cambridge Antibody Technology/Abbott 的Humira(adalimumab). Enbrel 为Amgen 公司开发的制剂,是TNF-α受体和 Fc 的融合蛋白,不仅对风湿性关节炎有非常 不错的疗效,且对牛皮癣及牛皮癣型关节炎也有明显的治疗作用,同时在促进脊椎炎愈合 的研究上,Enbrel 也进入了二期临床.2004 年销售额是

25 亿美元,预计

2008 年可达

34 亿 美元.Remicade 是一种人鼠嵌合性的抗 TNF-α单克隆抗体,可特异性结合可溶性及膜结合 型TNF-α,其适应症包括 Crohn'

病,风湿性关节炎(RA),重症强直性脊柱炎(AS) .在2003 年和

2004 年全球销售额分别是 22.7 亿和 28.9 亿美元, 是生物医药领域的 重磅炸弹 .

2002 年12 月Abbott 公司的 Humira 成为第一个获准用于减轻成人中到重度活动期 RA 的病 征和症状及抑制关节结构损伤进展的全人单克隆抗体.由于是全人抗体,避免了 Remicade 会产生免疫反应的缺点.Humira 与Remicade 及Enbrel 相比的另一个优势是给药方法的便 利上.Humira 每月只需注射两次,而Remicade 和Enbrel 必须每周注射两次.Humira 市场 占有率正逐年提高,2003 年和

2004 年的销售额分别是 2.8 亿和 8.5 亿美元. 这三个代表药物的疗效均比较确定,并且随着大规模临床试验的不断开展,除RA 以 外的克隆氏病、强直性脊柱炎、银屑病等其他自身免疫病也相继成为新的适应症,使其市 场更加庞大.这些生物产品的特异性高,靶向性好使其副作用较其他同类药物明显降低, 逐渐地与甲氨蝶呤合用作为 RA 的一线用药,并增强它们对目前中至重度的风湿性疾病等 其他自身免疫病市场的渗透.目前处于开发末期阶段的新药主要有 UCB/Celltech 公司的 CDP-870(PEG 化人源化抗 TNF 抗体 Fab 片段)和CDP571 (人源化抗 TNF 单抗),Bristol -Myers Squibb 公司的 CTLA4lg (Abatacept),Roche 公司的 Rituxan 和MRA 等.其中进展 最迅速的是 CDP-870,目前已经进入临床 III 期,预计 CDP-870 于2006 年底进入市场, CDP-870 应用大肠杆菌进行生产,使其成本降低至其他 TNF 抑制剂药物的四分之一. 虽然现有的 TNF 抗体类药物被认为较其它任何药物的效果都好,但它们也存在很大的 缺点.第一,它们均来自哺乳动物细胞表达和纯化,由于表达水平较低和生产能力有限远 远不能满足市场的需求, 即便是 Amgen 斥资

5 亿美金创建了全球最大的 20,000 升细胞培养 生物反应器,这一问题依然存在(据2004 年美国 biopharma 报告) ;

第二,这些抗体的高昂 成本使很大一部分患者被拒之门外,据估计,常规应用 Enbrel、Remicade 和Humira 治疗 RA 一年的费用分别是

11400、

14200 和16776 美金, 且需反复使用 (据2004 年美国 biopharma 报告) ;

第三,这些抗体所携带的 Fc 段具有结合补体和 ADCC 等活性,体内应用会导致表

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2 说明书达TNF 的细胞的凋亡,会产生一系列副作用;

第四,Remicade 是人鼠嵌合性单抗,含有 1/3 的鼠源蛋白成分, 连续注射可以在 10%以上的病人中激发人抗鼠源蛋白抗体反应或人抗 嵌合蛋白抗体反应, 影响治疗效果并可能导致严重的不良反应. 即将上市的 CDP870 是PEG 化人源化抗 TNF 抗体 Fab 段[17],其鼠源蛋白成分下降到 10%,但仍然有免疫原性.而Humir 的可变区的氨基酸序列和相应的 DNA 序列来自于 CAT 公司开发的人源抗体库,其Fc 片段的编码区来自人的 IgG1.由此可见,该产品的可变区序列并非直接来自人,而是来自 起源于人 B 细胞的抗体库. 此外,虽然人类免疫系统能够产生种类极其庞大的抗体,但是人或全人抗体技术却遇 到了瓶颈:人体内产生特异性抗体的前体细胞丰度很低,即使在抗体阳性的个体中,能够 产生特异性抗体的前体细胞也远远低于人杂交瘤技术所需要的能够产生特异性抗体细胞数 量.因此,分离、纯化和富集特异性分泌抗体的 B 细胞成为建立全人抗体平台的关键技术 之一. 发明内容 本发明建立了可以将能够分泌抗体的目的 B 细胞分离、纯化、富集和增殖的技术.B 细 胞亚克隆后所分泌抗体的特异性可以通过 ELISPOT、ELISA 等手段进行筛选和鉴定.从单克 隆培养的细胞株中获取目的抗体的基因序列,用以构建原核或真核表达载体,表达后即可 重建抗体的活性.本发明既是利用该平台从类风湿关节炎病人体的 B 细胞中获得抗人 TNFa 单克隆抗体,原核表达 Fab 和scFv 小分子抗体,发酵、纯化后,采用聚乙二醇化(PEG 化) 和纳米技术等方法体外改造和修饰,在保持其抗 TNF 活性的同时,使之更适合体内应用. 本发明一方面公开了一种抗人 TNFa 单克隆抗体,其轻链氨基酸序列为 SEQ ID NO:3, 重链氨基酸序列为 SEQ ID NO:4,优选的,上述抗体被 PEG 化. 本发明第二方面,公开了上述抗人 TNFa 单克隆抗体的 Fab 抗体.优选的,上述 Fab 抗 体被 PEG 化. 本发明第三方面提供了一种 PEG 化抗人 TNFa 单克隆抗体纳米颗粒, 为偶联上述 PEG 化 抗人 TNFa 单克隆抗体或其 Fab 抗体的纳米颗粒. 本发明第四方面,公开了上述 PEG 化抗人 TNFa 单克隆抗体纳米颗粒的制备方法,包括 下列步骤:

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3 说明书1)人TNFa 单克隆抗体或其 Fab 抗体的表达及纯化;

2)人TNFa 单克隆抗体或其 Fab 抗体的 PEG 化;

3)PEG 化的人 TNFa 单克隆抗体或其 Fab 抗体与纳米颗........