PDF《SHENTEK》

SHENTEK ? Vero 残留 DNA-154 检测 试剂盒 (PCR-荧光探针法)说明书 货号:SK030227V100 版本:A/0 仅供研究用 湖州申科生物技术有限公司 版本: A/0 SHENTEK? 第1页共7页?试剂盒简介 SHENTEK? Vero 残留 DNA-154 检测试剂盒用于定量检测各种 生物制品的中间品、半成品和成品中 Vero 宿主细胞 DNA 的专用 试剂盒.

本试剂盒利用 Taqman 探针原理,定量检测样本中 Vero 残留 DNA.检测快速,专一性强,性能可靠,最低检测限可以达到 fg 水平. 试剂盒配套有 Vero DNA 定量参考品. 本试剂盒与宿主细胞 残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用,可准确定量样本中 Vero 残留 DNA. ? 试剂盒成份 表1.试剂盒组份 组份 装量 储存条件 Vero DNA 定量参考品 50μl*1 管-18℃及以下 Vero Primer&Probe MIX-154 300μl*1 管-18℃及以下,避光 qPCR Reaction Buffer 850μl*2 管-18℃及以下,避光 DNA 稀释液 1.5ml*3 管-18℃及以下 ? 规格:100 Reactions. ? 有效期: 规定储存条件下

24 个月. ? 机型(已验证但不限于) ? PRISM? 7500(ABI) ? CFX96(Bio-Rad) ? LineGene 9600plus(博日) 版本: A/0 SHENTEK? 第2页共7页?实验所需但试剂盒中未含材料 ? 1.5ml 无菌低吸附离心管 ? qPCR 板或条 (与所使用的定量荧光 PCR 仪相适应) ? 1000μl,100μl,10μl 无菌低吸附带滤芯枪头 ? 相关设备 ? 荧光定量 PCR 仪?1000μl,100μl,10μl 移液枪 ? 操作过程 ? Vero DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备 用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 Vero DNA 定量参考品进行 梯度稀释,稀释浓度依次为 3ng/μl、300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、 300fg/μl,30fg/μl,3fg/μl,0.3fg/μl.具体操作如下: 1.将试剂盒中的 Vero DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰 上融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,短时间快速离心 10s. 2.取8支干净的 1.5ml 离心管,分别标记为 ST0,ST1,ST2, ST3,ST4,ST5,ST6,ST7. 3.在ST0 管中用 DNA 稀释液将 Vero DNA 定量参考品稀释至

3 ng/μl,振荡混匀后短时间快速离心 10s. 4.在ST1,ST2,ST3,ST4,ST5,ST6,ST7 管中分别加入 90μl DNA 稀释液. 5.按表

2 依次进行

7 次稀释操作. 版本: A/0 SHENTEK? 第3页共7页表2. Vero DNA 定量参考品的稀释 稀释管 稀释体积 浓度 ST1 10μl ST0+90μl DNA 稀释液 300pg/μl ST2 10μl ST1+90μl DNA 稀释液 30pg/μl ST3 10μl ST2+90μl DNA 稀释液 3pg/μl ST4 10μl ST3+90μl DNA 稀释液 300fg/μl ST5 10μl ST4+90μl DNA 稀释液 30fg/μl ST6 10μl ST5+90μl DNA 稀释液 3fg/μl ST7 10μl ST6+90μl DNA 稀释液 0.3fg/μl 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8℃. ? 加样回收质控 ERC 的制备 根据需要设置 ERC 中的 Vero DNA 加样浓度(以制备加 30pg Vero DNA 量的样本 ERC 为例) ,具体操作如下: 1.取100μl 待测样本加入 1.5ml 干净的离心管中. 2.再加入 10μl ST3,混匀,标记为样本 ERC. 样本 ERC 和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成 样本 ERC 纯化液. ? 阴性质控 NCS 的制备 根据实验设置阴性质控,具体操作如下: 1.取100μl 样本基质溶液(或DNA 稀释液)加入 1.5ml 干净 版本: A/0 SHENTEK? 第4页共7页的离心管中,标记为阴性质控 NCS. 阴性质控 NCS 和同批待测样本一起进行样本前处理,制 备成阴性质控 NCS 纯化液. ? qPCR 反应液的准备 1.根据所要检测的标准曲线及待测样本数量,计算所需反应 孔数,一般做

3 个重复孔/样. 反应孔数= (6 个浓度梯度的标准曲线+

1 个无模板对照 NTC+

1 个阴性质控 NCS +待测样本*2)*3 待测样本*2 是因为我们推荐每个待测样本检测时都应 同时做样本 ERC. 2.根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量: qPCR MIX =(反应孔数+2)* 20μl(含有

2 孔的损失量) 3.各试剂放在冰上融化,并根据表

3 所示准备 qPCR MIX: 表3. qPCR MIX 配制表 组份 单孔反应 qPCR Reaction Buffer 17μl Vero Primer&Probe MIX-154 3μl 总体积 20μl ? 加样 各试剂置于冰上,轻微振荡混匀,按表

4 所示加样: 版本: A/0 SHENTEK? 第5页共7页表4.各反应孔加样示例 标准曲线 20μl qPCR MIX+10μl ST2/ST3/ST4/ ST5/ST6/ST7 NTC 20μl qPCR MIX + 10μl DNA 稀释液 NCS 20μl qPCR MIX + 10μl 阴性质控 NCS 纯化液 待测样本 20μl qPCR MIX + 10μl 待测样本纯化液 样本 ERC 20μl qPCR MIX + 10μl 样本 ERC 纯化液 加样完成后每孔总体积为 30μl. 表5.

96 孔板排版示例 NTC S1 S1 S1 S1 ERC S1 ERC S1 ERC ST7 ST7 ST7 A NTC S2 S2 S2 S2 ERC S2 ERC S2 ERC ST6 ST6 ST6 B NTC S3 S3 S3 S3 ERC S3 ERC S3 ERC ST5 ST5 ST5 C S4 S4 S4 S4 ERC S4 ERC S4 ERC ST4 ST4 ST4 D NCS S5 S5 S5 S5 ERC S5 ERC S5 ERC ST3 ST3 ST3 E NCS ST2 ST2 ST2 F NCS G H

1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

11 12 该示例表示的是检测

6 个浓度梯度的 Vero DNA 标准曲线 (ST2~ST7) 、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、5 个待 测样本(S1~S5)和每个样本的 ERC(S1 ERC~S5 ERC) .每个 检测做

3 个重复孔. 实际检测时可根据样本多少,参照此示例样. 4. 将96 孔板用光学膜封闭,轻微震荡混匀,短时间快速离 心10s 后放入 qPCR 仪. 版本: A/0 SHENTEK? 第6页共7页?qPCR 程序参数设置 以AB 公司

7500 qPCR 仪、软件版本 1.4 为例. 1. 创建空白新程序,选择绝对定量检测模板. 2. 创建新检测探针,命名为 Vero-DNA,选择报告荧光基团 为FAM,猝灭荧光基团为 none,检测参比荧光为 ROX. 3. 设置两步法反应程序: 95℃预变性 10min;

95℃

15 s, 60℃

1 min,40 个循环;

反应体积 30μl. ? qPCR 结果分析 以AB 公司

7500 qPCR 仪、软件版本 1.4 为例. 1. 在Results 的Amplification Plot 面板中, 将Threshold 设置 为0.02, 点击 Analyze, 此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常. 2. 在Results 的Plate 面板中,将标准曲线孔的 Task 一栏设 置为 Standard,并且在 Quantity 一栏分别赋值为

300、

30、

3、0.

3、 0.

03、0.003(含义为每孔的 DNA 总量,单位为 pg) ,并且在相应 的sample name 一栏中命名为 ST

2、ST

3、ST

4、ST

5、ST

6、ST7. 3. 在Results 的Plate 面板中,将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC,将阴性质控 NCS 孔、待测样本孔、样本 ERC 孔的 Task 一栏设置为 Unknown, 并且在相应的 Sample Name 一栏 中命名为 NTC、NCS、S、ERC,之后点击 . 4. 在Results 的Standard Curve 面板中,可读取标准曲线的 斜率(Slope) 、截距(Intercept) 、R2. 5. 在Results 的Report 面板中, Mean Quantity 一栏可读取无 版本: A/0 SHENTEK? 第7页共7页模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样本、样本 ERC 的检测值, 单位为 pg/10μl. 后续可在检测报告中将单位换算为 pg/μl 或pg/ml. 结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版 本,一般也可由仪器自动判读. 根据待测样本和样本 ERC 的检测结果计算加样回收率, 加样回收率要求在 50%~150%之间. NTC、NCS 的Ct 值应大于标曲最低浓度(ST7) . 服务支持 湖州申科生物技术有限公司 www.shenkebio.com 地址:浙江省湖州市红丰路

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