PDF《AH109 感受态细胞 》

本产品仅供科研使用.

请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途. 北京庄盟国际生物基因科技有限公司Beijing Zoman Biotechnology Co.,Ltd. Order: 010-62617225 Technical: 010-62979301 Email: [email protected] ? ? ? ? ? AH109 感受态细胞? Cat.NO. ZC1604 产品介绍 : 本公司生产的 AH109 感受态细胞经特殊工艺制作,可用于 DNA 的化学转化,经pGADT7 质粒 检测转化效率高达

104 cfu/μg DNA, -80℃可保存三个月. 基因型为:MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS- GAL1TATA-HIS3, MEL1 GAL2UAS- GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ 产品特点 : AH109 菌株来源于 PJ69-2A 酵母菌株, 将lacZ 报告基因引入 PJ69-2A 诞生了 AH109, 此菌株 是Clontech 公司开发的 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株, MATa 型, 可直接转化质粒或与 MATα 型 酵母菌株 Y187 通过 mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验. Transformation marker 为: trp1, leu2, 报告基因为: lacZ, HIS3, ADE2, MEL1. AH109-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用: pGBKT7 和pGADT7. 质粒 pGBKT7 的筛选标志为 TRP1, 用于表达 DNA-BD( 来自酵母转录因子 GAL4N 端1~

174 位氨基酸 ) 与目标蛋白 (Bait) 的融合蛋白;

质粒 pGADT7 的筛选标志为 LEU, 用于 表达 AD(GAL4 C 端768~881 位氨基酸 ) 与目标蛋白 (Prey) 的融合蛋白. GAL4 系统原理: 一个完整 的酵母转录因子 GAL4 可分为功能上相互独立的两个结构域: 位于 N 端1~174 位氨基酸区段的 DNA 结合域 (DNA-BD) 和位于 C 端768~881 位氨基酸区段的转录激活域 (AD). DNA-BD 能够识别 GAL4- responsive gene 的上游激活序列 UAS, 并与之结合. 而AD 可以启动 UAS 下游的基因进行转录. BD 和AD 单独存在不能激活转录, 但当二者接近时, 则呈现完整的 GAL4 活性, 使含有 UAS 的启动子下游 基因转录表达. 正常条件下, BD 不与 AD 结合, 将要检测的蛋白质分别与 BD 和AD 融合, 形成 bait 融 合蛋白 (bait CBD) 和prey 融合蛋白 (prey-AD), 如果 bait 和prey 发生相互作用, 就会促使 BD 和AD 的相互接近, 形成完整的 GAL4, 从而激活报告基因的转录. AH109 有四个报告基因: lacZ, HIS3, ADE2, MEL1, 分别由三种不同的启动子 (GAL1, GAL2, MEL1) 启动, 这三种启动子只有 GAL4 识别 的17 bp 核心区相同, 其余部分均不同, 大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率. 操作方法 : 1.?取100?l 冰上融化的 Y187 感受态细胞, 依次加入预冷的目的质粒 2-5?g, Carrier DNA(95-100℃

5 min, 快速冰浴, 重复一次 ) 10?l, PEG/LiAc 500?l 并吸打几次混匀, 30℃水浴 30min (15min 时翻转 6-8 次混匀 ). 2.?将管放 42℃水浴 15min (7.5min 时翻转 6-8 次混匀 ). 3. 5000rpm 离心?40s 弃上清, ddH2O 400?l?重悬, 离心?30s 弃上清. 4. ddH2O 50?l 重悬, 涂板, 29℃培养 48-96h. AH109 Chemically Competent Cell 版本号:2018-10-31 感受态组成 保存 规格 AH109 Chemically Competent Cell -80℃(3 个月)

20 支*100μl pGADT7?(control vector,

10 ng/μl) -80℃(12 个月) 10μl Carrier DNA (5 μg/μl) -20℃(12 个月) 100μl?*2 PEG/LiAC 4℃(12 个月) 5ml*2 本产品仅供科研使用.请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途. 北京庄盟国际生物基因科技有限公司Beijing Zoman Biotechnology Co.,Ltd. Order: 010-62617225 Technical: 010-62979301 Email: [email protected] 注意事项 : 1. 感受态细胞最好在冰上融化. 2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量. 3. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量. 4. AH109酵母菌株对高温敏感, 最适生长温度为27-30℃ ;

高于31℃, 生长速度和转化效率呈指数下降. 5. 菌落变粉不是污染, 是酵母细胞生长中一个常见现象. 当细胞在平板培养几天后, 平板上的 Adenine 被酵母消耗完毕, 酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用, 然而, 有些菌株 的ADE2 基因被破坏, Adenine 合成途径受阻;

又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常, 所以造成中间产物 P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色. 6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢, 培养基中缺陷成分越多, 生长越慢, 以转化涂 板为例: 涂YPDA 平板 29℃, 48h 培养可见直径 1mm 克隆;

涂SD 单缺平板 29℃, 48-60h 培养 可见直径 1mm 克隆, 涂SD 双缺平板 29℃, 60-80h 培养可见直径 1mm 克隆, 涂SD 三缺或四缺 平板平板 29℃, 80-90h 培养可见直径 1mm 克隆.