PDF《兰氏磷脂脂肪酸分析方法及其在土壤微生物多样性 研究中的应...》

3 土壤与农业可持续发展国家重点实验室基金(055122) 资助 通讯作者 ,E2mail : zhongwenhui @njnu.

edu. cn 作者简介 :颜慧(1982~) ,女 ,汉族 ,江苏淮安人 ,硕士研究生 ,主要从事土壤微生物学和生物化学研究.E2mail : huixiaoyan @hotmail. com 收稿日期 :2005 -

10 -

31 ;

收到修改稿日期 :2006 -

03 -

22 磷脂脂肪酸分析方法及其在土壤微生物多样性 研究中的应用3 颜慧1 蔡祖聪2 钟文辉1 ,

2 (1 南京师范大学化学与环境科学学院 ,南京 210097) (2 土壤与农业可持续发展国家重点实验室(中国科学院南京土壤研究所) ,南京

210008 ) 摘要磷脂脂肪酸(PLFA) 是活体微生物细胞膜的重要组分 ,不同类群的微生物可通过不同的生化途 径合成不同的 PLFA.一些 PLFA 可作为分析微生物量和微生物群落结构变化的 生物标记 .在土壤微生物分 析中 ,越来越多地采用了 PLFA 方法.本文介绍了表征微生物的一些 PLFA、 从土壤中提取 PLFA 的方法以及用 GC2MS 分析 PLFA 的原理.本文还将常用的研究微生物多样性的几种方法进行了比较.传统的分析土壤微生 物群落的方法依赖于培养技术 ,只能培养和分离出一小部分微生物群落 ;

Biolog 方法可用于研究土壤微生物群 落生理多样性 ,即可反映微生物群落如何利用各种碳源底物 ,但对快速生长和适合在 Biolog 实验条件下生长的 小部分群落成员有强烈的选择性 ;

核酸分析方法的主要缺点是不能对土壤微生物进行定量分析 ;

而PLFA 方法 相对于上述几种方法有诸多优势.本文通过一些实例证明 PLFA 方法的特色或独到之处 ,也分析了其缺点. 采用 PLFA 方法并结合其他方法有助于获取土壤微生物群落多样性的更多和更全面而完整的信息. 关键词 土壤微生物 ;

磷脂脂肪酸 ;

生物量 ;

群落结构 ;

GC2MS(气相色谱- 质谱) ;

多样性 中图分类号 X172 文献标识码 A 土壤微生物参数很可能最早被用于表征土壤质 量[1] .土壤微生物群落的组成和活性很大程度上决 定生物地球化学循环、 土壤有机物的代谢过程以及 土壤的肥力和质量[1] .传统上 ,土壤微生物多样性 研究多依赖于培养方法和显微技术 ,即采用选择性 培养基从土壤样品中分离出纯菌株后进行鉴定 ,获 得可培养微生物的种类和数量信息.但该方法存在 以下缺点 : (1) 许多土壤微生物是不可培养的 ,分离 鉴定到的微生物只占土壤微生物总数的

1 %~

10 % ,因此 ,通过该传统方法只能得到微生物群落信 息的极小部分[2] .(2) 只能了解可培养的极少数微 生物数量和群落结构 ,具有选择性且不能对大多数 土壤微生物定量研究[3] .(3) 对于微生物群体相互 作用研究的贡献很小[3] . 目前 ,磷脂脂肪酸(PLFA) 分析被广泛地应用于 土壤微生物多样性研究.磷脂是所有生物活细胞重 要的的膜组分 ,在真核生物和细菌的膜中磷脂分别 占约

50 %和98 %[4] .PLFA 是磷脂的构成成分 ,它 具有结构多样性和生物特异性 ,土壤中 PLFA 的存 在及其丰度可揭示特定生物或生物种群的存在及其 丰度.磷脂在细胞死亡后快速降解 (厌氧条件下约 需2 d ,而好氧条件下约需 12~16 d) [5] ,故用以表征 微生物群落中 存活 的那部分群体.总之 ,通过对 PLFA 的定量测定可完成对了解微生物活细胞生物 量的测定 ,并可通过根据 PLFA 分析的种类了解土 壤微生物群落结构.

1 PLFA 可以作为土壤微生物标记物 生物标记物可分为通用生物标记物 ( General biomarkers) 和特定生物标记物 (Specific biomarkers) 两类.通用生物标记物可反映总生物量.如PLFA、 酯 链磷脂脂肪酸 ( EL2PLFA) 的总量可用于了解土壤微 生物总生物量[6 , 7] .革兰氏阳性和阴性细菌中均含 有单不饱和脂肪酸(MUFA) ,但在革兰氏阳性细菌中 它们对总 PLFA 的相对贡献很少( <

20 %) ,所以 MU2 FA 可用作革兰氏阴性细菌的通用生物标记[8] .甲第43 卷第5期土壤学报Vol143 ,No15

2006 年9月ACTA PEDOLOGICA SINICA Sep. ,2006 烷营养细菌特征性 PLFA 的总量可被当作甲烷营养 菌生物量[9] . 特定生物标记物表征特定微生物.总PLFA 谱 中某些特征脂肪酸分别对细菌、 真菌和放线菌是特 异的[10 ,11] ,且在大多数情况下 PLFA 的某专一类型 在某一土壤微生物分类中占优势.直链脂肪酸广泛 分布在微生物中.细菌除含有在其他生物中常见的 直链脂肪酸 ,如油酸或顺型异油酸 (十八碳2112烯酸 (顺) ,简写为 18∶

1 ω7) 外 ,还含有一些独特的脂肪 酸 ,如具有分支、 β 2羟基和环丙基的脂肪酸[12] .MU2 FA(单不饱和脂肪酸) (特别是 18∶

1 ω7) 是具有厌 氧- 去饱和酶途径的真细菌的特征脂肪酸[1] .支链 脂肪酸(异、 反异和支链的) 主要发现于革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性的硫酸盐还原菌、 Cytophaga 和黄杆 菌属 ( Flavobacterium) 中[13] ,而环丙基脂肪酸常见于 革兰氏阴性菌株和革兰氏阳性厌氧菌株[8] .非酯链 脂肪酸 (NEL2PLFAs) 是鞘酯、 缩醛磷脂和其他氨基 磷脂的组分.鞘酯已发现存在于拟杆菌属 ( Bac2 teroides) / 黄杆菌属中[14] .缩醛磷脂主要存在于梭状 芽孢杆菌属等厌氧细菌中[15] ,只有很少数的好氧和 兼性厌氧细菌含有缩醛磷脂[15 ,16] .在第

10 个碳上 有甲基支链的脂肪酸是放线菌所特有的[17] .多不 饱和脂肪酸 (PUFA) 只存在于蓝细菌 (cyanobacteria) 中 ,并被认为是原核生物的特征性脂肪酸.真菌菌 丝中已检测出存在长链非酯链羟基取代脂肪酸[18] . 特定生物标记物的数目随着所研究的脂肪酸的 增多而增加.特定生物标记物应该代表某一单独的 属或种 ,且在土壤中的浓度应该较大 ,这样才能便于 检测数量少的细菌[19] .可作为特定生物标记物的 一些脂肪酸列于表 1. 表1表征微生物的 PLFA[4 ,

15 ,16 , 20~24] Table

1 PLFA characterizing microbes 微生物类型 Microbial group 磷脂脂肪酸标记1) Phospholipids fatty acid signatures 细菌 Bacteria in general 含有以酯链与甘油相连的饱和或单不饱和脂肪酸① (如15∶

0、 i15∶

0、 a15∶

0、 16∶

0、 i16∶

0、 16∶

1 ω

5、 16∶

1 ω

9、 16∶

1 ω 7t 、 17∶

0、 i17∶

0、 a17∶

0、 cy17∶

0、 18∶

1 ω

5、 18∶

1 ω

7、 18∶

1 ω 7t 、 i19∶

0、 a19∶

0 和cy19∶

0 等) 革兰氏阳性细菌 Gram2positive bacteria 含有多种分枝脂肪酸② 革兰氏阴性细菌 Gram2negative bacteria 含有多种羟基脂肪酸③ 厌氧细菌 Anaerobes cy17∶

0、 cy19∶

0 好氧细菌 Aerobes 16∶

1 ω

7、 16∶

1 ω 7t 、 18∶

1 ω 7t 硫酸盐还原细菌 Sulfate2reducing bacteria 10Me16∶

0、 i17∶

1 ω

7、 17∶

1 ω

6 甲烷氧化菌 Methane2oxidizing bacteria 16∶

1 ω 8c、 16∶

1 ω 8t 、 16∶

1 ω 5c、 18∶

1 ω 8c、 18∶ 18t 、 18∶

1 ω 6c 嗜压/ 嗜冷细菌 Barophilic/ psychrophilic bacteria 20∶

5、 22∶

6 黄杆菌 Flavbacterium balustinum i17∶

1 ω

7 芽孢杆菌 Bacillus spp. 各种支链脂肪酸④ 放线菌 Actinomycetes 10Me16∶

0、 10Me17∶

0、 10Me18∶

0 等 真菌 Fungi 含有特有的磷脂脂肪酸⑤ (如18∶

1 ω

9、 18∶

2 ω

6、 18∶ 3)ω

6、 18∶

3 ω 3) 蓝细菌 Cyanobacteria 含有多不饱和脂肪酸⑥ (如18∶

2 ω 6) 微藻类 Microalgae 16∶

3 ω

3 原生动物 Protozoa 20∶

3 ω

6、 20∶

4 ω

6 脱硫细菌 Desulfobacteria cy18∶

0 (ω

7 ,8) 硫细菌 Sulfobacteria i17∶

1 ω

5、 10Me18∶

1 ω

6、 11Me18∶

1 ω

6 脱硫弧菌 Desulfovibrio i17∶

1 ω 7c、 i15∶

1 ω 7c、 i19∶

1 ω 7c 脱硫叶菌 Desulfobulbus 17∶

1 ω

6、 15∶

1 1) i 、 a、 cy 和Me 分别表示异、 反异、 环丙基和甲基分枝脂肪酸 ;

ω、 c 和t分别表示脂肪端、 顺式空间构造和反式空间构造 i , a , cy and Me refer to iso , anteiso , cyclopropyl and methyl branchingfatty acids , respectively;

ω, c and t refer to the aliphatic end , cis configuration and trans configuration , respec2 tively1 ① Containing saturated or monounsaturated fatty acids linked to glycerol with ester ;

② Containing a variety of branched fatty acids ;

③ Containing a variety of hydroxylated fatty acids ;

MUFA ;

④ Various branched chain fatty acids ;

⑤ Containing specific PLFAs ;

⑥ Containing polyunsaturated fatty acids

852 土壤学报43 卷2PLFA 的提取 PLFA 的提取和测定是PLFA 分析的关键. PLFA 的提取主要采用简单提取、 扩展提取和商用微 生物鉴定系统(MIDI) 提取等方法[1] .

211 简单提取 简单 提取用于提取酯链磷脂脂肪酸(EL2 PLFA) .基本过程如下[25~30] : (1) 脂类抽提 :按018∶ 1∶

2 的体积比向土样中 先后加入磷酸盐缓冲液 (011 mol L -

1 ,pH 710) 、 氯仿 和甲醇 ,所加试剂的具体量一般根据

1 g 土壤加1 ml 氯仿 的原则,再根据所用的土壤作适当的改变[31 ,32] .于暗处剧烈振荡

2 h ,离心.将上清液转 移到干净试管内 ,先后加入磷酸盐缓冲液和氯仿 ,剧 烈振荡 ,静置过夜.液体分为两相 ,膜脂分布于氯仿 层(下层) 中.用氮气吹干或不吹干直接进行下一步 固相抽提. (2) 固相抽提柱层析分离脂类 :将第 (1) 步萃取 得到的下层提取液上样于硅酸键合固相抽提柱 (Silicic acid bonded solid2phase2extraction column ,SPE2 SI) ,分别用氯仿、 丙酮和无水甲醇洗脱可将脂类裂 解并分离出中性脂、 糖脂和磷脂[32 ,33] .将含磷脂部 分(即甲醇部分) 用氮气吹干. (3) 磷脂的碱性甲醇水解和皂化 (甲基化) :磷 脂溶于甲苯∶甲醇混合液和

012 mol L -

1 氢氧化钠的 甲醇溶液 ,于37 ℃温育

15 min ,冷却至室温后用己 烷∶氯仿混合液、 1mol L -

1 乙酸和........