PDF《[ 应用实例 ]》

重组流感疫苗中血凝素上N-糖肽的分离与表征 Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skilton, and Jeffery R.

Mazzeo Waters Corporation, Milford, MA, U.S. 前言 [ 应用实例 ] 流感是一种呼吸道病毒感染,它是美国主要的致死原因之 一,每年有超过50,000人死于流感1 .流感疫苗是一种主要 的流感预防措施,也是降低季节性流感发病率和死亡率的 主要策略.疫苗通过结合病毒血凝素(HA)抗体为人体提供 保护,血凝素在流感感染中起到关键的作用. 经批准的季节性流感灭活疫苗通常含有规定量的HAs―H

1、 H3和B的混合物,对应3种最常见的病毒流感A亚型的H1N1和H3N2和流感B的HA蛋白.这些HA蛋白是糖蛋白类,每个糖基 化位点均含有多种N-糖基化基序且每个位点含多种糖形.由于HAs在流感结合至宿主细胞,即感染过程中的重要决定作 用,HAs中糖基化的精细鉴定和监测对疫苗的开发和生产都 非常重要. 目前,N-糖基化鉴定方法包括释放的游离聚糖分析2-4 和完整 质量分析5-7 .这些方法对于分析含确定糖基化位点的糖蛋白 类是有效的,如单克隆抗体.聚糖谱分析可在完整蛋白水 平(完整质量分析)或作为碳水化合物(游离聚糖谱)进行. 由于糖基化的天冬酰胺(N)残基的质量在去糖基化时增加了

1 Da,糖基化位点通常可由经酶(通常是 PNGase F)去除聚糖部 分后的肽谱来检测. 然而,这些方法很难区分同一蛋白不同糖基化位点上的聚 糖分子,因此用这些方法表征含多个糖基化位点的糖蛋白, 如HAs,是极富挑战的.而且,如疫苗等复杂样品均含有 带-NXS/T-基序的多个N糖基化位点.由于N位点修饰后1Da 质量增加可能是由其他位点糖基化或脱酰胺作用造成,通 过肽谱确定N-链糖基化位点是非常困难的. 采用UPLC? 革新的分离能力,经由LC/UV-MS系统分析了单克 隆鼠lgG1抗体胰蛋白酶消化所得胰蛋白酶肽的四种主要的 N-糖形9 .结果显示该方法可检测并量化糖基化.且采用该 方法可同时鉴定糖基化位点和聚糖分子. 在以前的研究中10-11 ,我们证实采用UPLC/MSE 获得的胰蛋白 酶肽谱能够准确的分离和鉴定位点特异性修饰,如N-去氨 酰作用和M-氧化. 在本应用实例中,我们证明UPLC/MSE 可区分离并鉴定由昆虫 细胞-杆状病毒重组表达系统(BEVS)表达的流感疫苗候选物 HAs蛋白的N-糖基化.糖肽和糖形可由ACQUITY UPLC? 系统在 多肽水平分离,并由SYNAPT?MS系统在线检测.UPLC/MSE 数 据经BiopharmaLynx?软件处理并报告N-糖基化信息.该方法 改进了表征质量并减少数据处理时间.此外,该方案有一 个为非专业研究者提供了解决这类问题的通用流程,工作 流程化可使整个团队受益. 实验 结果和讨论 [ 应用实例 ] 由昆虫细胞BEVS系统表达的含有HA蛋白H1,H3和B的流感 疫苗候选物经胰蛋白酶消化.肽段混合物含有N-糖肽及来 自于目的蛋白的其它肽段.制备的过程包括: 1. 蛋白溶解于0.05% RapiGest? SF、pH 7.4的溶液中,80 °C 加热10 min变性 2.

56 °C,DDT还原30 min 3. 黑暗,室温下采用碘乙酰胺烷基化30 min 4.

37 °C,pH 7.4下,胰蛋白酶消化4 hrs 5. 加入0.1%甲酸终止反应,并灭活胰蛋白酶 消化产物经汗0.1%甲酸的5%乙腈(ACN)溶液稀释成0.2 ìg/ìL, 用于UPLC/MS分析. UPLC/MSE 实验采用ACQUITY UPLC-SYNAPT质谱偶联系统分析. UPLC系统配置2.1 x

150 mm、BEH300 C18 1.7-ìm肽分离柱.取20-ìL含约4 ìg肽混合物进样,采用120-min 梯度洗脱(1至40% ACN0.1% FA溶液),流速0.2 mL/min,柱温60 °C.重复进 样四次. 采用ESI阳离子模式获得MSE 数据,低碰撞能(5 V)采集肽前 体(MS)数据和提高能量(20-40V之间调整)获得肽片段(MSE ) 数据.扫描时间为0.5秒(总工作周期1 sec).分析中各种参 数为:柱压3.0 kV,源温度100 °C,锥孔电压

37 V,且锥孔 气流10 L/h.该系统调至最低分辨率10,000(V-模式),并采 用100 fmol/ìL Glu1-fibrinopeptide B(GFP)校正, GFP由含0.1% FA 50:50 ACN/水溶液配制,通过lockspray通道每分钟进样一次 以确保高质量准确度. 采集的数据经BiopharmaLynx, v. 1.2,MassLynx? 软件的应用管 理程序进行处理,采用strict tryptic cleavage rule,且设置cysteine carbamidomethylation为固定修饰,以及N-糖基化作为可变修 饰.其它BiopharmaLynx 方法设置参照我们以前发表的文章.12 据报道13 ,昆虫细胞系表达的糖蛋白具有两种主要的N-聚 糖类型:少甘露糖苷结构(Man(1-3)GlcNAc2 or Man(1-3) GlcNAc[Fuc]GlcNAc)和寡聚甘露糖结构(Man(5-9)GlcNAc2),这里 Man表示甘露糖,GlcNAc为N-乙酰葡糖胺,而Fuc是海藻糖. BiopharmaLynx含有11种可能的可变N-糖基化修饰糖形.HA 蛋白H

1、H3和B的可能的N-糖基化位点(含-NXS/T基序)数目 分别为

9、12和10.对采集的UPLC/MSE 数据经BiopharmaLynx处 理后,可分别判定H

1、H3和B

7、4和6个N-糖基化位点.每个N-糖基化位点可能有多种连接的糖形.以下我们挑选出3 个典型样品(其中一个来自于疫苗样本中的HA蛋白),以阐 释UPLC/MSE 是如何用于分离和表征糖肽和糖形. 图1. HA蛋白B 中糖基化和未糖基化胰蛋白酶肽段 T8的分离和鉴定 A) 前体的提取离子色谱 B) B_T8(未指定离子m/z 1199.65 和m/z 1023.5为在疫苗制剂的过程中加入的Twin-20碎片)的MSE 谱C) B_T8*MSE 谱B) B_T8的MS E 谱#####-特征糖离子 (138.05, 204.09, 366.14, and 528.12) T8* T8* T8* Retention time (min)

65 67

69 A) 提取离子流色谱 甘露糖 N-乙酰葡糖胺 海藻糖 C) B_T8*的MS E 谱[应用实例 ] 图1显示了HA蛋白B中糖基化和未糖基化的胰蛋白肽T8(分 别命名为B_T8*和B_T8,在后面的文章中,所有的糖基化肽 均采用型号(*)标记以表明相应的修饰形式)的分离和鉴定. 由于添加的糖基团增加了亲水性,B_T8*洗脱较B_T8早(图1A).胰蛋白酶肽序列由MSE 谱确定(图1B和1C). B_T8*的糖基化由一系列低m/z范围的特征糖离子m/z 138.05, m/z 204.09,m/z 366.14和m/z 528.12展示,并由y28离子确证. y28糖基化修饰前后1038.36的质量变化与一种聚糖分子质 量相对应(-Man3NAcGlc[Fuc]NAcGlc).高m/z范围的糖基碎片离 子可以给出所连接聚糖分子的进一步结构信息.基于 BiopharmaLynx的质谱信号强度和前体物质的提取离子流色谱 面积,B_T8*的相对浓度为20%. 图2. HA蛋白H1中糖肽T24*的糖形的分离与鉴定 A) 前体的提取离子色谱 B) H1_T24*-Man3NAcGlc2 MSE 谱#C特征糖离子 # # # # # T24* T24 T24* T24* l A) 提取离子色谱 保留时间

63 63.5 64.5

64 B) B_T8的MSE 谱[应用实例 ] 与B_T8*不同,大多数已经鉴定的糖肽类是由多种糖形完全 糖基化的,如HA蛋白H1肽段T24,未检测出未修饰的 H1_T24,但H1_T24*的四种修饰糖形经层析法获得分离和鉴 定(图2A).糖形的洗脱顺序与聚糖的大小有关.聚糖越重, 这种聚糖形的糖基化肽洗脱越早.该肽含有两个N位点, 但MSE 谱确定糖基化仅发生在含有-NSS-基序的N286,而含 有-NVH-基序的N293则无糖基化修饰.这一现象与N-糖基 化仅发生在含有-NXS/T-基序的N位点的定律一致.图2B中 显示了H1_T24*-Man3NAcGlc2的MSE 谱.同样的,低m/z范围的 特征糖离子和高m/z范围的糖基碎片离子进一步确认了糖基 化并提供了聚糖分子的结构信息. 图3. HA蛋白H3中糖肽T21*糖形的分离和鉴定 A) MS谱B) H3_T21*-Man9NAcGlc2.的MSE 谱#C特征糖离子 B) B_T8的MSE 谱####T21* T21 T21* T21* T21* T21* / A) 提取离子色谱 Quadruple charged ions Triple charged ions [ 应用实例 ] 然而,并非所有已鉴定的糖形均可用层析法分离,如HA蛋白H3的胰蛋白酶肽T21中经鉴定的5种糖形(见图3A),但这 些糖形在91.65 min的同一个LC峰被洗脱.它们在提取离子 色谱的保留时间仅有微小差异(~ 2秒)(数据未显示). 这些证据和上述的例子表明糖形的色谱行为与聚糖连接的 肽序列的性质有关.H3_T21的肽段序列和糖基化可由MSE 谱确定.图3B中展示了一个H3_T21*-Man9NAcGlc2 MSE 谱的例 子. Waters, ACQUITY UPLC, 和UPLC 是沃特世公司的注册商标. SYNAPT, BiopharmaLynx, RapiGest,MassLynx, and The Science of What'

s Possible 是沃特世公司的商标.所有其他商标属于 各自所有者. ?2009 沃特世公司 中国印刷 2009年10月720003173ZH LB-PDF 讨论 参考文献 1. Stevens J, Corper AL, Basler CF, Taubenberger JK, Palese P, Wilson IA. Science. 2004;

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