PDF《CSPSTC》

25 g(mL)样品+225 mL 食源性共菌培养基

36 ℃±1 ℃,16 h~20 h 取100ul 共菌培养液收集菌体,提取核酸 浓度范围 50pg/ul~50ng/ul 配置反应体系,上芯片 上机 芯片离心 样本 T/CSPSTC X-2018

5 图2食品中常规致病菌的快速检测程序

6 操作步骤 6.1 增菌 称取25 g (mL) 样品放入盛有225mL食源性强型养基的无菌均质杯中, 以8

000 r/min~10

000 r/min 均质1 min~2 min, 或置于盛有225mL食源性增强型培养基的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打1 min~

2 min.若样品为液态,不需要均质,振荡混匀.无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中,如使用均质袋, 可直接进行培养,于36 ℃±1 ℃培养16 ~20 小时. 如为冷冻产品,应在45 ℃以下不超过15 分钟,或2 ℃~5 ℃不超过18 h解冻. 6.2 样本处理 吸取食源性增强型培养液100ul,12000 r/min,离心2 min,完全吸弃上清,加入700ul生理盐水, 震荡混匀,12000 r/min,离心2 min,弃上清,获得的菌体即可进行后续的基因组DNA提取. 6.3 基因组 DNA 提取 6.3.1 向所收集菌体中加入50~100ul核酸提取试剂,充分震荡混匀,使沉淀完全悬浮;

6.3.2 将悬浮液转移至核酸提取管中,旋紧管盖,使用漩涡振荡仪剧烈震荡5 min;

6.3.3 使用水浴锅,95 ℃加热5 min;

6.3.4 高速离心机,12000 r/min,离心5 min,将上清液转移至洁净离心管中,-20 ℃保存备用;

6.3.5 利用微型分光光度计进行核算浓度测定:50pg/ul-50ng/ul;

6.4 扩增反应 6.4.1 配置恒温扩增反应体系 将提取的基因组DNA与恒温扩增反应试剂混合进行扩增,见表2. 表1恒温扩增反应体系 反应物 体积(ul) 恒温扩增试剂

13 模板 DNA

13 共计

26 6.4.2 芯片加样 使碟式芯片恢复至室温, 吸取25ul配置好的核酸扩增反应体系, 从Ⅰ区进样口加入到芯片主通道中, 待其充满芯片主通道即可停止加样.用擦镜吸纸轻轻擦掉多余的液体;

Ⅱ区操作同Ⅰ区,取1张封口膜, 覆盖于进出样口上,再取一支洁净吸头,向一个方向按压封口膜至贴合紧密. 6.4.3 芯片离心 将加样后的芯片固定在低速离心机上,以6

000 r/min离心30 s后取下,如果芯片"V"型通道中仍 有气泡,可适当延长离心时间,直至气泡消失. 6.5 恒温扩增 输出报告 T/CSPSTC X-2018

6 将离心后的芯片固定在恒温扩增微流控核酸分析仪上,根据软件提示步骤进行操作,按照表3的核 酸扩增反应程序进行检测. 表2核酸扩增反应程序 步骤

1 2 温度(℃)

37 65 时间(分钟)

3 47

7 结果判读 检测完成后软件将自动进行数据处理和分析,自动生成检测报告. 7.1 结果判读标准 a) 信号值>背景信号平均值,且Tp 值≤Tp 阈值,且扩增倍数值≥扩增倍数阈值,该种情况下判 定为阳性;

b) 信号值>背景信号平均值,且Tp 值>Tp 阈值,且扩增倍数值