PDF《东理工大学学位论文》

华东理工大学学位论文基于纤维素酶分泌表达型乙醇发酵 E.

coli 工程菌的构建 张瑶 指导教师姓名: 鲍杰教授、华东理工大学 申请学位级别: 硕士 专业名称: 生物化工 论文定稿日期: 论文答辩日期: 学位授予单位: 华东理工大学 学位授予日期: 答辩委员会主席: (姓名、职称) 评阅人: (姓名、职称) 作者声明分类号: 密级: U D C: 我郑重声明:本人恪守学术道德,崇尚严谨学风.所呈交的学位论文,是本人在导 师的指导下,独立进行研究工作所取得的结果.除文中明确注明和引用的内容外,本论 文不包含任何他人已经发表或撰写过的内容. 论文为本人亲自撰写, 并对所写内容负责. 论文作者签名: 年月日华东理工大学硕士学位论文 第I页β-葡萄糖苷酶分泌表达型乙醇发酵 E. coli 工程菌的构建 摘要 由于化石燃料的日益枯竭和环境问题, 利用微生物将可再生资源转化为清洁能源越 来越受重视,而其中燃料乙醇因其优越的性能,有望成为未来替代石油的能源,而生产 纤维素乙醇的经济性是产业化的关键. 本文克隆了来自运动发酵单胞菌 Zymomonas mobilis ZM4 的丙酮酸脱羧酶基因 pdc 和乙醇脱氢酶基因 adhB,并通过 Red 重组将二者整合到大肠杆菌 JM109 基因组中.随 后将来源于多粘芽孢杆菌Bacillus polymyxa 1.794的β-葡萄糖苷酶基因bglB在E. coli P81 中进行了分泌超表达,得到重组菌 E. coli P81(pUC19-bglB).其胞外 β-糖苷酶酶活达到 82.6 mU/g protein,纤维二糖酶活达到了 25.8 mU/g protein.该重组菌 E. coli P81(pUC19-bglB)以纤维二糖为碳源进行乙醇发酵,乙醇得率达到了理论产率 60.9%,而 在葡萄糖和纤维二糖的共发酵中,其乙醇产量达到了理论产率 45.4%.本实验获得的此 株能够利用纤维素生产乙醇的 CBP 大肠杆菌,为构建能利用木质纤维素分解产物生产 燃料乙醇的高效、稳定的生产用工程菌奠定了良好的基础. 关键字:大肠杆菌,乙醇发酵,β-葡萄糖苷酶,分泌表达,CBP 华东理工大学硕士学位论文 第II 页Construction of CBP ethanologenic E. coli cells with secreted β-glucosidase expression Abstract: Recently, the production of clean energy from renewable resources has gained more attention because of the increasing depletion of fossil fuels and environmental concerns, and the because of the superior performance of fuel ethanol, bioethanol was regarded as the competitive potential alternative energy of oil, and the economical efficiency of cellulosic ethanol is the key to the industrialization. Here we cloned pyruvate decarboxylase gene pdc and alcohol dehydrogenase gene adhB from Zymomonas mobilis ZM4, then the two genes were integrated into Escherichia coli JM109 genome by Red recombination system and named the strain E. coli P81. The beta-glucosidase gene bglB from Bacillus polymyxa 1.794 was secretively expressed in the recombinant strain, and named the strain E. coli P81(pUC19-bglB). The extracellular glucosidase activity and the extracellular cellobiase activity of the recombinant strain reached 82.6 mU/g protein and 25.8 mU/g protein, respectively. The recombinant strain E. coli P81(pUC19-bglB) fermented cellulose to produce ethanol and reached theoretical yield 60.9%, and the co-fermentation of glucose and cellobiose to produce ethanol reached theoretical yield 45.4%. This E. coli CBP strain constructed above successfully converted cellobiose to bioethanol, that laid a foundation of constructing a highly efficient and stable CBP strain for converting lignocellulose to fuel ethanol. Key words: E. coli, ethanol fermentation, beta-glucosidase, secretive expression, CBP 华东理工大学硕士学位论文 第III 页目录目录.III 前言.V 第1章文献综述.1 1.1 生物乙醇概述.1 1.1.1 开发生物乙醇的意义.1 1.1.2 生物乙醇的历史和现状.1 1.2 木质纤维素.2 1.2.1 木质纤维素的概述.2 1.2.2 木质纤维素的组成.3 1.3 纤维素酶.4 1.3.2 β-葡萄糖苷酶.5 1.3.2 β-葡萄糖苷酶活力的测定方法.5 1.4 木质纤维质的利用.6 1.4.1 木质纤维素的代谢工艺.6 1.4.2 整合生物加工工艺.7 1.4.3 常见的 CBP 构建菌