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0 , 修回日期 :

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9 9 ―0 1―1 本 研究为 国家 自然科学 基金课题 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 唐家琪 等:汉坦 病毒核 壳蛋 白重 组抗 原的制 备和 基因 分型 的研究

3 1

5 补.含Sa1I酶切 位点 ;

引物

3 5 '

- T TG TC GA C TCT TcTG C c T T C A T G C T一3,与S片段 e DN A

5 9

5 ―

6 1 2序 列互 补.舍Sa1I酶切位 点 .根 据|仃Nv

7 6 .

1 1 8株及SEOV R

2 2株M片段 e DN A 序列.选取同源 性 较高 的G1区设 计 第二 组 引物 : 引物

4 5 '

- G C A TC A G TG A AG c u r m C -

3 , 与两型病 毒eDNA

1 1

9 9 ―

1 2

1 8序列相同;

引物

5 5 '

- GC A G ATGT G C C CA AC C A T G -

3 . 与两 型病 毒eDN A

1 4

9 7 ―

1 4

7 8序 列互 补 .上 述 引物 设计 经军事医学 科学 院王 槐春设 计的PCRDESN软 件进 一步分 析.证明符 合条 件,由中 国科 学院上海植物 生理研究所合成 .

1 .

3 试剂限制性 内切酶 、 T4 DNA连接 酶购自GIBCOBRL公司 . P C R试剂 盒购 自上 海 生工 生物工 程公司.逆转录 酶试剂 盒为 美国Prome g a公 司产 品.标准DN A和 标准 蛋白Ma r k e r及其 他 常规 试剂均购自华 美 生物 工 程公 司.

1 .

4 毒株汉滩型 标准 株7

6 ―

1 l

8 、 汉 城型 标准株R22由中 国预 防 医学 科学 院病毒所抗长寿教 授惠赠,本所 V e r o - E 6细胞 传代 或 鼠脑传 代作为 阳性 对照 ;

特检 毒株:鲁胎 ( 山东 病胎儿) 、 A

5 3

7 ( 福建 黑 线姬 鼠)、B5(浙江 病 人血 ) 、 S

3 5 ( 上海 病人 血)、A3(浙江 黑线姬 鼠) 、 HR

5 4 ( 河南 褐家鼠) 、 HI

4 ( 陕西 病人 血)、鲁姚(山东 病人血)、R2(安徽 、 褐家 鼠) 、 H

3 ( 湖北 病人 血)、鲁徐( 山东 病人血 ) 、

1 -

1 5 ( 安徽 、 黑 龙江 病 人血 ) 、 A9

6 ( 安徽 黑线姬鼠)、C4(安徽 家猫 ) 、 R

2 7 ( 河南褐家鼠) 、 R( 安徽 大白鼠) 、 A

2 1

6 ( I ~ I J t l黑线 姬鼠) 、 L R

1 ( 甘肃 病 人血 ) 、Hu h e i ( 湖北 病人血)、A1

0 1

8 ( 湖北 黑线 姬鼠) 、 L

9 9 ( 江西 黄毛鼠)、R1

7 8 ( 福建褐家 鼠)、A1

6 ( 陕西黑线姬鼠)、R36(云南 揭家 鼠) 、 R3

0 ( 云南 褐家 鼠)、C10(安徽家猫 ) 、 B l

1 ( 安徽 病人血)、S45(上海 病人血)、A59(云南高山姬鼠) 、 R r ( 安徽大白鼠 ) 、 Hu ( 山东病人尿)、肿(安徽 病人血)、B78(山东 病人血)、E142(云南 滇绒鼠) 、 J

1 0 ( 辽宁褐家 鼠) 、 陈株( C h e r t ) 、 A 9共计

3 7株 由安徽 省 医学 科学研 究 所倪 大石教 授 惠赠 , 车所鼠脑 传 代保 存;

未感 染HFRSV的正 常BAL B / e小 鼠鼠瞄标 本 3份和正 常We r e - E 6细胞 标车 2份.共5份为 阴性 对照 .

1 . s 血清和单克 隆抗 体HF R S患者 血清 6份 由江 苏省卫生防 疫站 意赠.阴性 对 照血 清 3份 采 自非 HF RS 疫 区的 健康献 血员.抗核 壳蛋白单 克隆抗 体H5由第 四军 医大学棣 志凯 教授 惠赠 a

1 .

6 重组 质粒 的构 建用引物

1 和弓I物2 扩增 出 S基 因全长 编码 区片段 , 约1.3kb;

用引物

1 和弓l物3扩 增出S基 因部 分编 码 区片段 , 约6O0bp;

分别用 限制性 内切酶 Nc oI、 s I酶切上 述扩 增 的棱 苷酸 片段和 质粒 载体pTSAPA及 p E t .

2 8 a . 以低熔 点琼脂 糖 电泳 回收 目的片段 , 然 后进行 连接 反应 .用 连接产 物转 化感受态宿 主菌E. c........