PDF《产方法》

16 点之后与结扎雄鼠合笼.输卵管移植当天早上挑选有阴道栓的雌鼠作为代孕鼠进行胚胎移 T/CALAS XXXXX―XXXX

4 植. 7.1.3 供卵雌鼠的超数排卵和供精雄鼠的准备 一般选择需要进行生物净化的 4~8 周的雌鼠进行超数排卵, 第一天供卵鼠注射 PMSG 5IU/只,48 小时后注射 HCG 5IU/只,15 小时后进行取输卵管.供精雄鼠一般选择

8 周以上需要进行生物净化的小 鼠.进行生物净化的供卵雌鼠和供精雄鼠基因型一样或者为同背景小鼠. 7.1.4 体外受精培养液的准备 ①精子培养皿:1 个0.2ml 的HTF(见附录 B)精子培养液液滴. ②受精培养皿:1 个0.2ml 的HTF 培养液液滴.注意:该HTF 中加入 0.5 微升 GSH 溶液(每毫升 HTF 配0.0307 克L-Glutathione reduced). ③清洗用培养皿:3 个0.04ml 的HTF 培养液液滴. ④培养用培养皿:1 个0.2ml 的HTF 培养液液滴. 图一体外受精平皿: 7.1.5 体外受精 将供精雄鼠处死后取附睾尾部, 用精细镊子夹住附睾尾部, 在其头部用注射器避开血管扎 3~4 个孔. 再取另一精细镊子,交替向前挤压,挤出附睾尾部的精子团.用解剖针将精子团导入精子培养皿中于 37℃,5%CO2 的培养箱培养

1 个小时. 卵母细胞采集已注射 HCG 后约

15 小时的超排小鼠输卵管,显微镜下用一把眼科镊子固定住输卵 管,用一把眼科镊划破输卵管的膨大部,带出卵母细胞团至受精用培养液滴中. 使用移液器取一定数量(约7-15 微升,以精子密度大小而变)培养 1h 后的精子悬浮液置于含有卵 母细胞团的受精用 HTF 培养液液滴中,于37℃,5%CO2 的培养箱中培养 3.5-5 小时后,将胚胎移至 HTF 培养液液滴中,置于培养箱(37℃,5%CO2)中培养过夜. T/CALAS XXXXX―XXXX

5 次日用口吸管将发育至 2-细胞阶段的胚胎挑出来,统计 2-细胞胚胎的数量,计算受精率(受精率 =2-cell 胚胎数/胚胎总数, 胚胎总数=单细胞胚胎数+异形胚胎数+2-cell 胚胎数) , 2-细胞胚可用于移植或 者冷冻保存. 7.1.6 小鼠输卵管移植与术后护理 挑选有阴道栓的雌鼠作为代孕鼠,在小鼠背部第

一、第二腰椎处剪一小口,并剪开肌层,用镊子将 脂肪组织提起,把卵巢、输卵管、子宫移出,在体视显微镜下找输卵管的伞口和壶腹部,将18~25 枚2-细胞吹进输卵管(如图二,卵巢到输卵管的位置)进行移植. 图二输卵管移植 7.1.7 小鼠产仔和病原检测 统计产仔数量,并在仔鼠出生

4 周后对其进行《GB 14922.1-2001 实验动物寄生虫学等级及监测》 和《GB 14922.2-2011 实验动物微生物学等级及监测》的检测. 7.2 剖腹产 7.2.1 代乳母鼠的准备 代乳鼠是指与剖腹产母鼠同步生产或者预定剖腹产前已经生产的 SPF 级健康母鼠.一般通过检查雌 鼠阴道栓的方法准备. 7.2.2 怀孕母鼠 怀孕母鼠是需要进行生物净化的雌鼠.同样通过检查雌鼠阴道栓的方法知晓母鼠产仔的时间. 7.2.3 剖腹产过程 拉颈处死怀孕母鼠,迅速在碘酒中浸泡取出.用手术剪刀打开腹腔,连带卵巢等将含有胎儿的子宫 取出,将子宫置于灭菌手术巾上,快速打开子宫壁.从子宫内迅速取出胎儿,剪开羊膜,并剪短脐带. 用灭菌棉签纸仔细擦掉胎儿身上的羊水、血液和分泌物等.将仔鼠置于 37℃的恒温台上,用精细镊子 交替轻夹每个小鼠的尾部,直至开始呼吸,身体表面变成粉红色. T/CALAS XXXXX―XXXX

6 从笼内取出代乳母鼠.取出一半左右的仔鼠,如果原仔鼠与剖腹产仔鼠的颜色相同,则原仔鼠可以 剪脚趾进行标记.放入与取出数基本一致的剖腹产仔鼠,用笼内的垫料放在剖腹产仔鼠身上,以混合亲 子与代乳鼠的气味.将母鼠放回笼内让其自然哺乳. 7.2.4 仔鼠病原检测 统计产仔数量,并在仔鼠出生