PDF《产品说明书》

1 /

2 US EVERBRIGHT? INC.

技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com 产品说明书产品名称:Firefly & Renilla Dual Luciferase Assay Kit(双萤光素酶报告基因检测试剂盒) 产品货号:F6075 产品规格:100T,1000T 产品内容: 组分

100 T

1000 T A. 5*Passive Luciferase Lysis Buffer

10 mL

100 mL B. Firefly Luciferase Assay Buffer

10 mL

100 mL C. D-Luciferin

2 mg

20 mg D. Renilla Luciferase Assay Buffer

10 mL

100 mL E. 50* Coelenterazine

200 ? L

2 mL 储存条件 -80℃避光保存.Firefly Luciferase Assay Buffer 和Renilla Luciferase Assay Buffer 在-80℃至少可以保存6个月, 试剂盒其他组分在≤-20℃可以稳定保存

6 个月. Assay Buffer 需分装后保存,避免反复冻融. 产品介绍 Firefly & Renilla Dual Luciferase Assay Kit(双萤光素酶 报告基因检测试剂盒)为双报告基因检测提供有效的手段. 在DLR 检测中, 萤火虫 (Firefly) 萤光素酶和海肾 (Renilla) 萤光素酶的活性可在单个样品中依次检测. 首先是先以萤光 素(luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase), 后以肠腔素(coelenterazine)为底物来检测海肾萤光素酶 (Renilla luciferase),并且在后续加入海肾萤光素酶底物时, 同时加入抑制萤火虫荧光素酶催化 luciferin 发光的物质, 使 后续检测仅仅检测到海肾萤光素酶的活性, 实现双萤光素酶 报告基因检测.通过萤光素酶和其底物这一生物发光体系, 可以非常灵敏、高效地检测基因的表达. 通常把感兴趣基因 的转录调控元件或 5'启动子区克隆在 luciferase 的上游,或把3'-UTR 区克隆在 luciferase 的下游等,构建成报告基因 (reporter gene)质粒.然后转染细胞,用适当药物等处理细胞 后裂解细胞, 测定萤光素酶活性. 通过萤光素酶活性的高低 来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用. Renilla luciferase 相对更多地被用作转染效率的内参,以消除细胞 数量和转染效率的差异. 萤火虫萤光素酶是一种分子量约为 61kD 的蛋白,在ATP、镁离子和氧气存在的条件下,可以催化 luciferin 氧化 成oxyluciferin, 在luciferin 氧化的过程中, 会发出生物萤光 (bioluminescence).海肾萤光素酶是一种分子量约为 36kD 的蛋白,在氧气存在的条件下,可以催化 coelenterazine 氧 化成 coelenteramide,在coelenterazine 氧化的过程中也会发 出生物萤光.生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer) 或液闪测定仪进行测定. 该试剂盒具有检测迅速、 灵敏度高、 检测范围广,无细胞内源活性干扰等特点. 使用方法 1.细胞裂解 1.1 将转入报告基因的细胞中的培养基移除, 加PBS 轻轻 洗涤两次 (贴壁细胞可直接进行此操作, 悬浮细胞要离心收 集细胞) .按如下方案加入 1* Lysis Buffer (用无菌水按 4:1 稀释 5*Firefly Luciferase Lysis Buffer), 然后将培养板放在 微型震荡器上室温震荡

15 min,充分裂解细胞.

2 /

2 US EVERBRIGHT? INC. 技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com 细胞培 养板

96 孔板

48 孔板

24 孔板

12 孔板

6 孔板 细胞裂 解液 30? L 60? L 120? L 250? L 500? L 注:裂解产物可室温保存

6 h,-70℃可长期存放(裂解产物 不能多次反复冻融) .如果萤光素酶的表达水平比较低,可 以尝试使用更少的裂解液, 例如

6 孔板的每孔用量可以最小 为100 微升. 1.2 将充分裂解后的裂解产物,10000-15000 rpm 离心 3-5 min.离心后将上清液移入新的 EP 管中进行后续检测. 注:细胞裂解后可以立即测定萤光素酶,也可以先冻存,待 以后再测定.冻存样品需融解,并达到室温后再进行测定. 2. 工作液配制 2.1 用Firefly Luciferase Assay Buffer 充分溶解 D-Luciferin, 配制成 0.2 mg/mL 的萤火虫荧光素检测液. 注:萤火虫荧光素酶工作液不能长时间保存, 也不能反复冻 融,若单次实验用量较少, 建议先用去离子水配制大浓度的 10*或50* D-Luciferin 储液,比如 5mg/mL,分装成小规 格(避免反复冻融) ,-20℃或更低温度保存,使用时再用 Firefly Luciferase Assay Buffer 稀释成工作浓度即可. 2.2 用Renilla Luciferase Assay Buffer 将50* Coelenterazine 稀释成 1* Coelenterazine 工作液,稀释方法为将 1? L50X Coelenterazine 加入到