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novoprolabs.com 染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南 ? ChIP 基本原理 ? ChIP 一般流程 ? ChIP 实验步骤 ? ChIP 注意事项 ? ChIP 常见问题及解决方法

2 上海纽普生物科技有限公司 公司网站:http://www.novoprolabs.com ChIP 基本原理 ChIP 是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通 过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得 蛋白质与 DNA 相互作用的信息.ChIP 不仅可以检测体内反式因子与 DNA 的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各 种共价修饰与基因表达的关系.而且,ChIP 与其他方法的结合,扩大了其应用范围:ChIP 与基因芯片相结合建立的 ChIP-on-ChIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;

ChIP 与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的 体内结合位点;

RNA-ChIP 用于研究 RNA 在基因表达调控中的作用.由此可见,随着 ChIP 的进一步完善,它必将会 在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用. ChIP 一般流程 甲醛处理细胞→收集细胞,超声破碎→加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA 复合物相互结合→加入 ProteinA, 结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物,并沉淀→对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合→洗脱,得到富集 的靶蛋白-DNA 复合物→解交联,纯化富集的 DNA-片断→qPCR 分析. 在qPCR 分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR.但是现在随着荧光定量 PCR 的普及,纽普生物建议使用 qPCR,更能反映实验结果. 此外,RIP 其实就是用 ChIP 的方法研究细胞内蛋白与 RNA 的相互结合,具体方法和 ChIP 差不多,只是实验过 程中要注意防止 RNase 对RNA 的降解,最后分析的时候需要先将 RNA 逆转录成为 cDNA;

ChIP-ChIP 其实就是 ChIP 富集得到的 DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在 ChIP 的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司 的要求来准备样品. ChIP 实验步骤 以下介绍的经典操作流程需要三天时间. 第一天:

(一) 、细胞的甲醛交联与超声破碎.

1、取出

1 平皿细胞(10cm 平皿) ,加入

243 μl 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为 1%(培养基共有 9ml) .

2、37℃孵育 10min.

3、 终止交联: 加甘氨酸至终浓度为 0.125M.

450 μl 2.5M 甘氨酸于平皿中. 混匀后, 在室温下放置 5min 即可.

4、吸尽培养基,用冰冷的 PBS 清洗细胞

2 次.

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5、细胞刮刀收集细胞于 15ml 离心管中(PBS 依次为 5ml,3ml 和3ml) .预冷后 2000rpm 5min 收集细胞.

6、倒去上清.按照细胞量,加入 SDS Lysis Buffer.使得细胞终浓度为每 200μl 含2*106 个细胞.这样每

100 μl 溶液含 1*106 个细胞,再加入蛋白酶抑制剂复合物.假设 MCF7 长满板为 5*106 个细胞. 本次细胞长得约为 80%满度,即为 4*106 个细胞.因此每管加入 400μl SDS Lysis Buffer.将2管混在一起,共800μl.

7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5s 冲击,9s 间隙.共14 次.

(二) 、除杂及抗体哺育.

8、超声破碎结束后,10,000g 4℃离心 10min.去除不溶物质.留取 300μl 做实验,其余保存于-80℃.300μl 中,100μl 加抗体做为实验组;

100μl 不加抗体做为对照组;

100μl 加入 4μl 5M NaCl(NaCl 终浓度为 0.2M) ,65℃ 处理 3h 解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果.