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9、在100μl 的超声破碎产物中,加入 900μl ChIP 稀释缓冲液和 20μl 的50*PIC.再各加入 60μl Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA.4℃颠转混匀 1h.

10、1h 后,在4℃ 静置 10min 沉淀,700rpm 离心 1min.

11、取上清.各留取 20μl 做为 input.一管中加入 1μl 抗体,另一管中则不加抗体.4℃颠转过夜.

(三) 、检验超声破碎的效果. 取100μl 超声破碎后产物,加入 4μl 5M NaCl,65℃处理 2h 解交联.分出一半用酚/氯仿抽提.琼脂糖电泳检 测超声效果. 第二天:

(一) 、免疫复合物的沉淀及清洗.

12、孵育过夜后,每管中加入 60μl Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA.4℃颠转 2h.

13、4℃静置 10min 后,700rpm 离心 1min.除去上清.

14、 依次用下列溶液清洗沉淀复合物. 清洗的步骤: 加入溶液, 在4℃颠转 10min, 4℃静置 10min 沉淀, 700rpm 离心 1min,除去上清. 洗涤溶液: a. low salt wash buffer-one wash b. highsalt wash buffer-one wash c. LiCl wash buffer-one wash d. TE buffer-two wash

15、清洗完毕后,开始洗脱.洗脱液的配方:100μl 10%SDS,100μl 1M NaHCO3,800μlddH2O,共1ml. 每管加入 250μl 洗脱 buffer,室温下颠转 15min,静置离心后,收集上清.重复洗涤一次.最终的洗脱液为每管

500 μl.

16、解交联:每管中加入 20μl 5M NaCl(NaCl 终浓度为 0.2M) .混匀,65℃解交联过夜. 第三天:

(一) 、DNA 样品的回收

17、解交联结束后,每管加入 1μl RNaseA(MBI) ,37℃孵育 1h.

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18、每管加入 10μl 0.5M EDTA,20μl 1M Tris.HCl(PH6.5) ,2μl 10mg/ml 蛋白酶 K.45℃处理 2h.

19、DNA 片段的回收:omega 胶回收试剂盒.最终的样品溶于 100μl ddH2O.

(二) 、qPCR 分析 ChIP 注意事项 IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的 prorein A 特异性地结合到免疫球蛋白的 FC 片段的 现象开发出来的方法.目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的beads 上,使之与含有抗原的溶液及抗 体反应后,beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的. 首先,实验最需要注意的就是抗体的性质.抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在 IP 反应. 纽普生物建议仔细检查抗体的说明书.特别是多抗的特异性是问题. 其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质.多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其 溶解.为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合.另一面,如用弱界 面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白.即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影 响与抗体的结合,即使 IP 成功,也是很多蛋白与抗体共沉淀悲惨结果. 再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂,低温下进行实验.每次实验之前, 首先考虑抗体/缓冲液的比例.抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在 beads 上,残存在上清.缓冲剂太少 则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释. ChIP 常见问题及解决方法 问题 可能原因 解决办........