PDF《常国权 ,冯 书章》

1 材料与方法

1 .

1 病毒 与细胞 病 毒系 从 患传 染 性肝 炎 的病犬 体 内分 离的ICHVA一

8 3

0 1 株I

3 】 , 病毒滴度为

1 0 ~ ~ V C I D5 d O .

1 mL. 细胞为犬肾传代细胞,按常规培养传代.

1 .

2 豚曩抗 I C HVI g G 自制,其血凝抑制试验滴度为 1:

6 4 .

1 .

3 探针的制备与标记 按 白丽萍等 的方法制 备ICHVDNA 探针.用 光化学法将生物素标记在探针上【

5 】 .

1 .

4 L o w i c r y l K

4 M 低温包埋样品的制备 收稿 日期:2

0 0

2 ―

0 8 ―

2 6 ,修回日期 :2

0 0

2 ―

1 0 ―

1 8 作 者简 介:常国权(1963一),男, 山东 荣成 籍 ,副研 究员 ,硕士,研究 方 向为病 毒形 态学 与形 态发 生学 . 维普资讯 http://www.cqvip.com 常国权 . 包涵体―― 犬传 染性 肝炎病毒 形态发生学的重要特 征153将ICHV接种于长 成 良好 单层犬肾传 代细胞上.按毒后

2 2 、

2 4和48h分别 刮取 细胞,1500r/mi n 离心

1 5 mi n ,加入 含2%多聚 甲醛 和0.025%戊 二醛 的0.01mo l / L P BS ( p H

7 .

2 )于4℃固定

4 h .经PBS洗3次后 ,按Roth等【 o 的程 序脱 水 、包埋 .聚合后的样 品置于

4 ℃避 光干燥 保存.1.5免疫金电镜方法 按常规方法将包埋后的样品切片,并打捞在不 锈钢 网上 ,用1%卵 蛋 白室温 封闭30min,加适当稀 释 的豚 鼠抗 I C HV I g G,室温 作用

2 h .P B S洗 涤后 加入胶体金标记葡萄球菌蛋白A( S i g ma公司产品, 金 颗粒直 径为10nm) ,室温 作用

1 h ,用PBS和 蒸馏水各 洗 3次 ,铀和 铅双 染色 .

1 .

6 电镜原位杂交方法 按常规方法将包埋后的样品切片 ,并打捞在不 锈钢 网上 ,2 *S S C 平衡

1 5 m i n后用 变性 液(70%去离 子 甲酰胺 ,2 *S S C)在65℃处理 样品lOmin.变性 后 的样 品在预 杂 交液 中(50%甲酰胺 ,

2 *S S C,

1 %牛血 清 白蛋 白,1 *d e n h a r t S ,

1 0 0u g / mL 鲑精 D NA)3

7 ℃预 处理

1 5 mi n ,继而 在杂 交液 中(预杂 交液 ,1 u g / mL生物素探针.探针与预杂交液混合 前 ,先 在沸 水 中变 性2~3 mi n ,然后 迅速 转移 至冰 浴)3

7 C杂 交过 液 .杂 交后 首先 用含

5 0 %甲酰 胺的2*S S C 液37℃洗

3 0 mi n ,再 用含 与不 含50%甲酰 胺的1*S S C液分别洗

3 0 m i n ,经PBS过 渡10mi n 后,以1%牛 血清 白蛋 白于

3 7 ℃封闭30mi n ,然后加入适当稀释 的羊抗生物素I g G( S i g ma 公司产品) , 室温 反应2h后用 P B S洗 3次 .与直 径10nm的胶 体 金偶 联 的二抗 是兔 抗羊 I g G ( S i g ma公 司产 品),使用 时1:

5 0 稀释于PBS中,室温反应

1 h后用PBS和蒸馏 水各 洗 3次 ,铀 和铅双 染色 . 超 薄切 片 置于 J E M一1200EXII透射电镜 下观 察 和照 像.实验 设 正常 细胞和 感 染细胞 ( 免疫 金标 记法 用正常豚 鼠IgG代替 豚 鼠抗 I C HV I g G, 电镜 原位 杂 交法用 P B S代替探针 )对照,处理步骤相同.

2 结果本实验 中我们分别观察了病毒感染后

2 2 、2

4 和48h的细胞,所见结果基本一致 ,叙述如下: 松散均质包涵体这种包涵体是由电子 密度较低 的均 质所 组成 ,散在分 布 于感染 的细 胞核 中,常靠近细胞核膜并可突破核膜进入扩张的核 周间隙(图1A) .包涵体数量 多而 形态 变化 较大 ,可呈圆形 ,肾形或 多形 性 .在 包涵 体 的周 围常可 见 到正 在构形和已成熟的病毒颗粒.这种包涵体可被免疫 金 所标 记.副结晶包涵 体 这种 包涵 体是 由紧 密排 列的图1ICHV包涵体形态学 A,松散 均质 包涵 体(箭头 ) ;