PDF《技术手册》

2、使用无菌无 RNase 的塑料制品和 Tip 头.

3、若使用玻璃器皿须经过 0.1%DEPC 水在 37℃下浸泡

12 小时,然后经过 120℃高压灭 菌30 分钟,烘干后使用.

4、配制相应的试剂必须使用经过 120℃高压灭菌的 0.1% DEPC 水. 不同细胞的破碎方法 为确保RNA抽提成功,选择合适的细胞破碎方法,保证样品在内源RNase作用前得到 充分裂解是至关重要的.具体为:细菌采用溶菌酶破壁;

植物组织要用液氮碾磨破碎;

动 物组织可用组织匀浆器或液氮碾磨破碎.而选择液氮碾磨是破碎细胞的最佳方案.不同材 料的裂解方法详见本手册各章节所描述的裂解物的制备. 溶液准备步聚注意事项DNA酶I 按DNA酶I(冻干粉)瓶标 所示, 加入550μl无核酸酶 水(试剂盒已提供) 轻轻地旋转混匀溶液, 不要震荡. 我们 建议将溶解后的DNA酶I分装到无核酸 酶的EP管内(如,分成5-10等份)并于-20℃保存.单次RNA的提取需要使 用5μl DNA酶I !不要震荡DNA酶I溶液 !不要超过3次反复冻融DNA酶I溶液 RNA裂解液 将1-硫代甘油按2% (V/V) 加入到RNA裂解液中 加入1-硫代甘油后,即在瓶子上做好标 记. 将RNA裂解液保存在4℃环境, 保存 期10周,每次使用后,请拧紧瓶盖. RNA洗液 向40ml浓缩的RNA洗液 中加入70ml无水乙醇. 加入乙醇后, 即在瓶子上做好标记. 试 剂可保存于15- 30℃环境中, 请拧紧瓶 盖. 订购电话及技术支持请联系:普洛麦格(北京)生物技术有限公司

电话:010-58256268 传真:010-58256160

网址:www.promega.com.cn 第3页,共13 页 上海普洛麦格生物产品有限公司 使用液氮破碎细胞要特别注意:在整个液氮碾磨过程中,必须不断添加液氮,避免样 品融化,在碾磨结束样品融化前必须立刻加入裂解液,用移液枪反复吹打直到裂解物中无 明显块状组织.有些样品(如胰脏)含有大量核酸、细胞碎片和蛋白质,如果加入 RNA 裂解液后,裂解混合物很粘稠不易吸取时,可以使用 20G(或国产

9 号注射针头)的注射 器来回吸放数次,使裂解物便于吸取即可. 匀浆好的裂解物可以保存在-70℃备用.如果收集的样品不马上进行RNA的提取工作, 就需要将离体后的组织迅速投入液氮冻住后再保存于-70℃冰箱或直接保存于液氮中直到使 用,防止反复冻融. 不同样品最适起始用量 样品的起始用量对 RNA 的提取效果有很大影响,任何裂解系统在接近样品最大起始 量时,抽提效果会明显下降.使用该试剂盒最佳样品起始用量为:细胞最佳用量 3x106 , 植物组织 50mg,动物组织 20mg.对含基因组 DNA 特别丰富的组织(如:脾脏)应减少 起始用量.当抽提的 RNA 质量欠佳时,考虑解决的办法是降低样品的起始用量.如果想 获得更多提纯的 RNA,可以按比例放大样品处理量以及后续各试剂用量,分批上样过柱. 在实验之前,请参考表一:不同样品起始用量与裂解液,稀释液的使用量进行裂解物的制 备. 表1. 不同样品起始用量与裂解液,稀释液的使用量 样品名称 样品起始用量 裂解液使用量 稀释液使用量 普通动物组织(肝脏、肾脏、心、肺、脑,等) 5-20mg 300?l 300?l 普通动物组织(肝脏、肾脏、心、肺、脑,等) 20-40mg 500?l 500?l 特殊动物组(脾脏等) 5-10mg 300?l 300?l 悬浮或贴壁细胞 1.5*103 -5*106 300?l 300?l 植物组织 (叶片,茎) 30-50mg 300?l 300?l 植物组织(叶片,茎) 50-100mg 500?l 500?l 细菌,OD600 达0.6-1.0 时1ml 200?l 300?l 订购电话及技术支持请联系:普洛麦格(北京)生物技术有限公司