PDF《表达轮状病毒 G2 和G3 型vp7 基因重组腺病毒的免疫效果 3》

33 通迅作者. Corresponding author. Tel :010263518290 ,E2mail : wangjw28 @vip. sina. com. ? 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 高达

870 000 人[1 ] .鉴于 RV 危害严重且无有效的 治疗手段 ,WHO 已将 RV 疫苗列为最优先发展的 疫苗项目之一.目前正在研制的候选 RV 疫苗包括 重配或减毒疫苗、 灭活疫苗、 病毒样颗粒 (VL P) 疫苗、 亚单位疫苗、 转基因植物疫苗和 DNA 疫苗等 , 动物实验表明这些疫苗的免疫保护效果差异较 大[2~4 ] .美国 Wyeth 公司生产的四价人 - 猴RV 重组疫苗是第一个被批准上市的 RV 疫苗 ,但因怀 疑引起儿童肠套叠而被暂停使用[1 ] .因此 , RV 新 型疫苗的研究仍在探索之中. 与国外策略不同 ,我们拟以非复制型腺病毒载 体表达 RV 的VP7 等重要结构蛋白作为口服或滴 鼻疫苗.由于 A 组轮状病毒血清型众多 ,单价疫苗 恐怕难以取得较全面的保护效果.疫苗研究的实践 表明 ,对于基于中和性抗原的疫苗 ,多价疫苗的效果 要好于单价疫苗 ,而我们对我国 A 组RV 感染状况 的调查结果显示 ,绝大部分为 G1 型(89.

5 %) 感染 , 少数为 G2 和G3 型(6.

1 % , 2.

8 %) 感染[5 ] .因此 , 我们的疫苗设计方案主要包括 G

1、 G2 和G3 型3种不同的 VP7 抗原.此前 ,我们利用表达我国 RV 主要流行株 G1 型VP7 的非复制型重组腺病毒免疫 小鼠 ,获得了较好的效果[6 ,7 ] ;

随后我们又制备了表 达我 国G2 和G3 型流行株的重组腺病毒rvAdG2VP7 和rvAdG3VP7[8 ] .在前期工作的基 础上 ,本文对 rvAdG2VP7 和rvAdG3VP7 的免疫 效果进行了研究 ,以期为新型 RV 基因工程疫苗的 研究提供依据.

1 材料和方法 1.

1 细胞和病毒

293 细胞购自美国 A TCC , MA104 细胞为本室 保存.人RV RV25 株( G2 型) 、 Wa 株(G1 型) 和猴 RV SA11 株(G3 型) 均由美国 NIH Kapikian 博士 惠赠.重组腺病毒 rvAdG2VP7 和rvAdG3VP7 为 本室构建[8 ] . 1.

2 免疫学试剂 辣根过氧化物酶 ( HRP) 标记的羊抗鼠和兔抗 羊IgG 均为美国 Santa Cruz 公司产品 , HRP 标记 的羊抗鼠 IgA 为美国 Sigma 公司产品 ;

山羊抗 RV 抗体为美国 Chemicon International 公司产品 ;

小鼠 IgG1/ IgG2a 抗体检测试剂盒为美国 Southern Bio2 technology Associates 产品 ;

小鼠 IL24 和IFN2 γ定 量检测试剂盒为瑞典 Amersham Biosciences 产品 ;

ConA 为美国 Sigma 公司产品. 1.

3 病毒培养 按常规方法培养

293 细胞和 MA104 细胞 ,分 别用于重组腺病毒 rvAdG2VP

7、 rvAdG3VP7 和RV 的增殖 ,具体方法见文献[9 ] . 1.

4 动物实验 SPF 级RV 抗体阴性 6~8 周龄雌性 Balb/ c 小 鼠购自军事医学科学院实验动物中心 ,随机分为

3 组.实验组分别经滴鼻和灌胃途径接种重组腺病毒 rvAdG2VP7 (以下简称 G2 组) 或rvAdG3VP7 (以下 简称 G3 组) ,对照组为野生型

5 型腺病毒 (以下简 称Ad5 组) ,每种途径均接种

10 只小鼠.鼻腔接种 剂量为

100 μL

1 *

107 荧光形成单位 (ifu) 腺病毒 ,灌 胃组的接种剂量为

200 μL

1 *

107 ifu 腺病毒.在初 次免疫后第

4、 第6周进行加强免疫并采集血清. 第3次免疫 7d 后,每组分别取

5 只小鼠眼球采血 后处死 ,取脾分离脾淋巴细胞 , 测定 IL24 和IFN2 γ. 同时制备肺、 肠匀浆液和肺灌洗液 ,用于 RV 特异性 黏膜免疫反应的检测.具体方法参见[6 ,7 ] . 1.

5 RV特异性抗体的测定 以培养的 RV 为抗原 ,用间接 ELISA 法测定 RV 特异性 IgG和IgA 抗体水平 ,具体方法参考文献[10] . 小鼠血清中 IgG1/ IgG2a 的测定参见文献[11] . 1.