PDF《冯玲 玲》

病 毒学杂 志叉',烤流感病毒复制过程 中神经氨酸酶的免疫荧光特 点林乔冯玲玲 何敏王愁梁 ' 湖北省医学科学院 病毒研究 所,武汉 提要用二种杭 甲型 流感病毒 神经 氨 酸酶 的单克隆抗体 研究流感病毒 在猴 肾细胞 内复制 过程中病 毒 神经 氨 酸酶 的 免疫荧光 特点,结果 阐明了神经 氨酸酶的细胞 内过程 及其发生 的构 象改变,并观察了抗神经 氨 酸酶 单 克隆 抗体 对 病毒 穿入细胞 的影 响.

流感病 毒有血 凝 素和 神经 氨酸酶二 种 表面 抗原 . 病毒依靠血 凝 素结合在靶 细胞含唾 液酸的受体 上,并参与膜融 合过 程,使病毒核 衣 壳进 入细 胞质而 引起感 染.神经 氨酸酶 可能参与病毒 从宿 主细 胞表 面 的释放 , 但对其在病毒复制过 程 中的确切 作用 尚不清 楚.目前对血 凝 素在病 毒穿 入、脱衣壳和释放 等各 阶段 中的行为和 构象 改 变已有不 少研 究〔 ' 一", , 但对 神经 氨酸酶在病毒 复制过 程 中的情 况 了解 很少.本文用 抗 甲型 流感病毒 上海 神经 氨 酸酶 单 克隆抗 体研 究流 感 病毒 在猴 肾 细胞 复制 过程中病毒 神经 氨酸酶 的免 疫荧光特 点,以阐明病毒神经 氨酸酶 的 细胞 内过 程 及构象改 变.材料与方法 病毒甲型流 感病毒 上海 , 接种 于 日龄鸡胚 尿 囊液 , ℃温育小时后 , 收 取尿 囊液 , 用 常规 方法测定 病毒血 凝 单位 , 并浓缩到 , 毫升.细胞传代 猴 肾细 胞 ℃下在 含小牛血清 的培养基 中培养 . 细胞在 毫米盖 玻片 上长成 单层 后,接种流感病毒 . 在.℃放 置分钟后 , 用洗涤三 次,再转移 到 含有 稀释的单克 隆腹 水 抗体 的培养基 中.经℃温育、、、.和分钟 后,分别 取 出一 张盖 玻片进 行免 疫荧 光检 查.抗体 抗 上海 病毒 神经 氨酸酶 的单克隆抗体 的制备 及性质 见文 献〔'〕.本研 究选 用二 株单克隆抗体 和,其中结合于酶活性部位 附近 的抗原 表位 , 而 结合 于远 离活性部位 的抗原 表位 . 异 硫氰酸盐荧光 素标 记的兔抗 鼠抗体由本所 自行备 制,其效价 为.免疫荧 光 试验 受病毒 感染 的细 胞单层 载 玻片经不 同时 间温 育后取 出,用冷本文 于年月日收到,本文联 系人 . 病毒学杂志 .' , 筑 .匕 培养 基洗涤三 次,再在 冷丙酮 内固定 分钟.固定后 , 用 洗涤三 次.滴加 荧光素 交 联的 兔抗 鼠抗体微升,再在 ℃下 温育 小时 . 经 洗涤后用 缓冲甘油封 片,用日产 荧 光显 微镜 观 察结果 . 结果 与讨 论、流感病毒神经 氨 酸酶的细胞 内过 程图流感病毒 上海感染细胞 后,单克隆 抗体 和检出的 病毒神经氨酸酶的免 疫荧光 . 一感染后 、 、 、 . 、 和 分钟 ' 钾五垃忿,一,,

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二病毒学 志杂 , , 一.在℃用 流感病 毒 上海 〔 感染猴肾细 胞后 , 病毒吸 附在细胞 表面,整个细 胞 表面 呈现 大 片荧光 图.接种 病毒半小 时后 , 吸 附的病 毒 进细入 胞,表现为 细胞表面 荧光减少 , 并向核周 集中.核周小 空泡 是溶酶体的特 征〔句,说明 病毒粒子 已被转 移到溶酶 体中 图.感染后 一 小时 , 核膜 及核周 小范 围 内荧光 逐 渐扩大 , 强度 也逐渐 增强.这些部位系细 胞 内质 网所 在,说明同血凝 素一样 , 神经 氨 酸酶 的生物合成 也 与细胞 内质 网有关 图、、.感染后 小时,细胞 表面 又重 新遍布荧 光,提示 此 时大量 新 复制 的病毒 已 出现 在细 胞 的表面 图.图培养基 中存在 和不存在 氯化 按的情况下病毒感 染分钟时 抗体 俭出细胞中的免 疫荧光一主

二、在病毒复 制过程 中神经氨酸酶 的构象改 变抗体和在病毒 复制 过程中所 检 出的神经 氨酸酶 的免 疫 荧光呈现 完全不 同的 二 种类型 图和.开始 时,和均结合于细 胞表面 的 病毒 , 但是 检 出的免 疫荧光强 , 而 检出 的免 疫荧光较弱 . 温育 一分钟,吸附的病毒 进入 细 胞内 . 此时,的荧光 减弱 , 而 的荧光却逐 渐增 强,说明病毒进入 细胞溶酶 体后 , 神经 氨 酸酶 发生 了 明显 的构象改 变,使不易与内在 化 的病毒 神经 氨酸酶 结合 , 而更易与内在 化的神经 氨酸酶 结合.而培养基 中存在 氯化钱 " 情况下进 行温育时 , 病毒 进入 细胞后 , 检 出的免 疫荧光不 再增 强.据认为 , 加入氯化钱 后,溶酶体 内增高厂 , , 神经 氨酸酶 不能发生构 象改 变,因此 也不 再能与其 相 结合 图.随着 温育 时间的延 长,检出的免 疫 荧光逐渐增 强,进一步说 明较易结合于与内质 网有 关的或不成熟 的内 在 化病毒 . 感染小时 , 病毒 到达细胞 表面后,检出的免疫荧光又 明显减弱 , 而 此时 检出的免 疫荧光又重 新增 强,说明识别 的抗原决定簇是感 染后 期产 生的抗原决定簇 .

三、抗神经氨酸酶 单克隆抗体对 病毒穿入 细胞的影响 流感病毒 上海 与等量 抗体 或 稀释 混合 , 存盯 ℃温育 分钟后 , 再感染猴 肾细胞 . 感 染后 小时 内,二种抗体检出的免疫荧光始 病 毒学杂 志,'终布满整个细胞 的表面 , 不再向核 周 集中 . 说 明这二 种 抗体 与病毒 神经 氨酸酶 的结合 部 位尽管 相距 甚远,但是均 能 有效地 阻止 病毒进 入细胞.以往认为 , 抗 神经 氨 酸酶 血清 抗 体不 能通 过阻断病毒 附着和 复制 来 中和 病毒 的感 染性 〔 " . 等近来 通过在抗神经 氨酸酶 抗 体存在 下选 择 出神经 氨 酸酶 抗原突 变株 , 表明抗神经 氨酸酶 单克隆 抗体能 有效 地 中和 病毒〔.〕 . 本研究则进 一 步证实抗 神经氨 酸酶单 克 隆抗 体 中和 病毒的机 理 之一是 阻 止病毒进 入细 胞.参考文献〔〕〔〕〔〕〔〕〔〕〔〕〔〕〔〕〔〕一,.,,

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厂一王愁梁等,中华微 生 物学 和免疫学杂 志,待发表 , , , , 一,,

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