PDF《标准操作程序》

医院人感染 H7N9 禽流感病毒核酸检测 标准操作程序

一、目的 确保人感染 H7N9 禽流感病毒核酸检测过程标准化、规 范化,降低人为不规范操作对检测结果造成的影响,保证结 果的准确性和可重复性.

二、适用范围 医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展 人感染 H7N9 禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》(卫办 医政函〔2013〕383 号)和《关于做好医疗机构人感染 H7N9 禽流感检测试剂供给保障工作的通知》(卫发明电〔2013〕

29 号)有关要求,使用国家疾病预防控制中心制备或商品化 试剂盒开展人感染 H7N9 禽流感病毒核酸检测工作.

三、样本采集、运送和保存 尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包 括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸 道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等).可将 鼻、咽拭子收集于同一采样管中,以便提高检出率.患者有 下呼吸道样本时,应优先采集. 根据试剂说明书对样本采集方法有关要求,制订样本采 集标准操作程序(SOP),并组织样本采集人员进行培训及 考核.样本的采集应当严格按照 SOP 进行. 样本采集后,按照《人间传染病的病原微生物名录》中 高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装,用密封容器立即 送往实验室.若气温高时,需放入冰块降温.样本抵达实验 室后,应尽快进行检测,24 小时内能检测的样本可置于 2~ 8℃暂时保存,

24 小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状 态保存.如无-70℃保存条件时,可于-20℃冰箱暂存.样本 避免反复冻融. 样本采集、处理、运输及保存不当时,可因病毒 RNA 降 解出现假阴性结果, 也可因为样本 污染 出现假阳性结果.

四、PCR 检测

(一)样本处理 样本的核酸提取应当在样本处理区进行.按所采用的商 品化试剂盒说明书要求,取适量待检样本、阳性及阴性对照 进行核酸提取.样本应尽可能新鲜,提取过程应严防 RNA 酶 污染及操作不当导致的 RNA 降解. 提取过程如涉及离心步骤, 应采用低温冷冻离心机;

在生物安全柜内进行加样、提取过 程中,为防止 RNA 降解,可将试管架置于托盘内平铺的碎冰 上.提取好的 RNA 应及时用于检测,否则应当-70℃保存. 如无-70℃保存条件,可于-20℃冰箱暂存.

(二)试剂准备 试剂准备应当在试剂准备区进行.根据所用的试剂盒, 样本可进行甲型流感病毒核酸、禽流感 H7 亚型或 H7N9 病毒 核酸的检测.试剂的配制按所用商品化试剂盒说明书进行. 除酶混合物外,其它试剂在使用前应当在室温充分复融,混 匀并瞬时低速离心.反应液分装时尽量避免产生气泡,上机 前注意检查各反应管是否盖紧,以免管内溶液泄露污染仪器. 分装有扩增反应液的反应管应当扣盖或装入密实袋内再转 移至样本处理区.

(三)加样 加样应当在样本处理区进行.加样时应当使样品完全落 入反应液中,不应有样品粘附于管壁上,加样后应尽快盖紧 管盖. 按试剂、仪器说明书完成加样和 PCR 反应管准备.

(四)PCR 扩增检测 PCR 扩增检测在扩增区进行. 待检 PCR 管转移至扩增区, 按顺序置于 PCR 仪上,编辑样本信息,按试剂和仪器说明书 设定循环参数.

(五)结果分析 根据所用试剂盒说明书设置基线值(baseline).荧光 阈值(threshold)设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增 曲线(无规则的噪音线)的最高点为原则,且Ct 值应大于 所设置的扩增循环数(或显示为 undet).使用仪器配套软 件自动分析结果.