PDF《重组及表达》

4 (CTLA24) 是下 调或终止 T 细胞反应的重要协同刺激分子[1 ] ,CT2 LA24Ig 能有效阻断免疫反应 ,诱导免疫耐受 ,但缺乏 特异性[2 ] .研究发现 Gravesπ病患者甲状腺组织浸 润T淋巴细胞为寡克隆性[3 ] ,存在某些 TCRV β或TCRV α[4 ] 基因家族亚型基因的优势利用现象 ,其中 TCRV β

8 为TCRV β优势利用基因之一[5 ] .基因重 组、 表达CTLA242TCRV β

8 融合蛋白,既利用TCRV β

8 优势基因产物阻断 TCR 对特异性抗原的 识别 ,又利用 CTLA24 阻断协同刺激信号 ,以达到同 时阻断 T 细胞激活依赖的双信号作用 ,从而抑制或 避免甲状腺特异性 T 细胞活化 ,来解决或部分解决

4 期王晶,朱 江 ,朱本章 ,等. T 细胞 CTLA

24、 TCRV β

8 基因克隆、 重组及表达 CTLA24 诱导免疫耐受的特异性问题.本实验构建了 pcDNA3. 1( + )2CTLA242TCRV β

8 质粒 ,并在大肠杆菌 中诱导其表达 ,初步验证了融合蛋白的生物活性.

1 材料与方法 1.

1 主要试剂 pcDNA3.

1 ( + ) 、 p ET28a ( + ) 质粒 由本校免疫病理教研室提供 , Trizol 购自 Invitrogen 公司 ,反转录试剂盒购自 MBI 公司 , Taq 酶购自 Stratagene 公司 ,dN TP 购自 Toyobo 公司 ,各种限制 性内切酶、 T4 DNA 连接酶购自 Ta KaRa 公司 , PCR 引物由上海生工公司合成 ,质粒提取试剂盒购自 Omega公司 ,胶回收试剂盒购自 U2gene 公司 ,小鼠 Anti2His Antibody、 HRP2羊抗鼠 IgG 多克隆抗体购 自华美生物工程公司. 1.

2 方法 1. 2.

1 RNA 提取和 cDNA 合成 用Trizol 法提取 Gravesπ病患者甲状腺组织 T 淋巴细胞 mRNA .按MBI 逆转录试剂盒说明书逆转录反应获取 cDNA . 1. 2.

2 PCR 扩增 CTLA24 的基因片段 根据 GenBank 中CTLA24 胞外段的基因序列(基因文库号 :L15006) 设计引物.上游 : 5′ 2CTGGA TCCGCCGCCACA TG2 GCTTGCCTTGGA TTTC23′ ;

下游:5′ 2CA GAA T2 TCA GAA TCTGGGCACGGTTC23′ , 含Bam H Ⅰ和EcoR Ⅰ 酶切位点 ,同时上游引物 5′ 端加入 Kozak 序列.PCR 反应按本室常规方法进行 ,PCR 产物用

15 g/ L 琼脂糖凝胶电泳检测. 1. 2.

3 重组质粒 pcDNA3.

1 ( + )2CTLA24 的构建 CTLA24 基因片段和 pcDNA3. 1( + )质粒经 B am H Ⅰ 和EcoR Ⅰ 双酶切后 ,回收酶切片断.用T4 DNA 连接 酶连接.连接产物转化 E. coli D H5 α,提取质粒 ,进 行双酶切及测序鉴定获得正确重组质粒. 1. 2.

4 PCR 扩增 TCRV β

8 的基因片段 根据 GenBank 中TCRV β

8 的基因序列 (基因文库号:X00437) 设计引 物.上游:5′ 2CTGAATTCATGGACTCCTGGACCTT23′ ;

下游: 5′ 2CACTCGAGCT ACTCACTCACGGGCTGCTC2 CTTGAGGGGCTGCG 23′ ,含EcoR Ⅰ 和Xho Ⅰ酶切位 点 ,同时下游引物 5'

端加入能适应三种不同读码框架 的终止密码子.PCR 反应按本室常规方法进行 ,产 物用

15 g/ L 琼脂糖凝胶电泳检测. 1. 2.

5 重组质粒 pcDNA3.

1 ( + )2CTLA242TCRV β

8 的构建 TCRV β

8 基因片断和 pcDNA 3.

1 ( + )2CT2 LA24 质粒经 EcoR Ⅰ 和Xho Ⅰ 双酶切后 ,回收酶切片 段.用T4 DNA 连接酶连接.连接产物转化 E. coli D H5 α,提取质粒 ,进行双酶切及测序鉴定获得正确 重组质粒 pcDNA3.

1 ( + )2CTLA242TCRV β 8. 1. 2.

6 PCR 扩增 CTLA242TCRV β

8 目的基因片段 从正确的重组子 pcDNA3.

1 ( + )2CTLA242TCRV β

8 上 扩增.上游引物 : 5′ 2CTGGATCCATGGCTTGCCTT2 GGATTTC23′ ;

下游引物:5′ 2CACTCGAGGGGCT2 GCTCCTTGAGGGGCTGCG 23′ ,含Bam H Ⅰ 和Xho Ⅰ 酶切位点.PCR 产物用