PDF《报道以 质粒p》

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7 一第9卷 第期1.

994年

1 2月中国病毒学VIR0L0G l CA SI NI CA . ;

f ) V0 I .9 N o .4 De c .

1 9 9d 伪狂犬病毒闽 A株基因文库的构建及物理图谱分析 汪铭 书 郭万柱 - ・― ―- -. - -― ―- - - - 一, ( 四川 农业大学 , 四川雅 安B25014).华/争/1300B2)z.h-――――_一y ( 一^ / , 一(中国人民解艘军农牧大学.长眷―jO/ 一L//4提 要本 文报道以质粒pE啦322作载体,用鸟枪法克隆出了PRv圆A株除Ba玎证{I一1.2外的所有酶切片殷 ・ 构 建了 P R V闽A株基 蚓文库 . 并克隆出的 B a m H I片段用 光生物 素标记 作探针 . 应用 分子 杂交法确定了 P R V闽 A株绝大部分限制性内 伪狂犬病毒 ( P R V) 是 多种家 畜和野生 动物均可感染 的一 种传染病 的病原 , 它属 于 疱疹 病毒[

1 ] . 基 因组 为一 线性双链 D N A, 分 子量

9 0 *1

0 . 道尔顿 , 核酸长度约

1 5

0 k b [ . 分子病 毒学在阐 明基 因和 产物结扮与功能的基础上有可 能提示病毒感染病 的本 质,从而为诊 断控制病 毒病 提供有效 的方法和手段 . 因此 国外对 P R V分子 生物学方面 的研究 已越来越 深入 , 不仅 确定了许 多毒株 的物理图谱和基 因组中各段基 因的功能[ , 且在此基 础上对一 些 毒株的基 因组进 行 改造 . 获得 了各种有用的基因缺 失苗[ . 但 国内毒株分子生物 学方面的研 究 未见报道 , 我们认为这 一部 分工 作是对 P RV深入研究并有效地 控制 、 最终消灭 伪狂犬病不 可缺少的部分 .为此 本研究克隆和 构建出了 P R V A株 的基 因文库并 对其物理 图谱进 行了定 位.材料和方法 l 材料1.1细胞及毒抹 P 细胞及 P R V瓯『A抹均由t I 国兽药监察所提供.

1 .

2 茁株及质粒宿主茁 且DHfa(F一,crflA一,一,rl;

F―cZya)及质粒 p B R

3 2 2购自BRL公司 , 质粒 P N d - I B ( 台PRV一B片殷) 由荷兰 L e l y s ~ a d・ 央兽医研究所病 毒系G 瑚k c ∞A . L J . 博士惠赠.

1 .

3 硝基轩维紊膜赡 自B R L公司I 各种工具酶驶主要试剂购自华美生物工程公司 } 光生物素购自 R e s e a r c h O r . g a I n0 USA.

1 ・

4 主要 仪器kn1a.I(w-B型 ) 冷 冻离 心机 、 T G u -

1 8 A高速 冷 冻离心 机、sHz一8Z型 水 浴恒 温振荡器 、 D F - C 型恒 压恒 流 电泳仪 、 T R -

3 1

2 A , ] A短波 紫外透射 仪.2方法2.1病毒 D N A的提取 将病毒接种到长成 层的P K , 细胞. , 当细胞出

7 5 - -1

0 0 %~细胞病变 (

2 4 - -7

2 小 本文于

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9 3 年9H28日 收到,

1 0 月2

3 日 修回 维普资讯 http://www.cqvip.com

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8 中国病毒学第9卷时)时,按文献 介绍 的方 法提 取病 毒NDA.

2 .

2 重组质 粒的 构建 技酶切 鉴定 经BamH I 酶解 井用 碱性磷酸 酶除 去5末端 磷酸 的pBR3

2 2和经BamH I 酶解的PRV闽 A D N A 于l2―16 C下 加入T4D NA连接 酶作用12--2 4小 时后 - 转化经CaCh致 敏的虽DHS a . 并以Amp和'

Iet琼脂 平扳 筛建 出Amp'

和P的阳性菌 落.阳性 菌落 用Trit~- l y z o mc 法提 取重 组质粒 , 酶切后 与经 B 帅m酶切的 P R V闽A1 ) N 一 同电 泳-重组片段 与PRV闽 A D N A的带 谱进 行 比较 . 考u步鉴定 出重组 质粒 驶所属 的片段 .

2 .

3 探针的光生物翥标记及 S o t h c m 转印杂交 经酶切初步鉴定的B a m H I 片段及 p N I H B片段 , 甩光生物索标 i g t , ] 作探针 , 与Southexll转移 至硝基纤维紊膜上的 P R V闽A/Band-]I驶.PRV闽 A / X l ~ I 片段 - 采用甲酰 胺杂交系统进行杂交[ . ] . 具体方法接文献进行 .据杂交结果鉴定出重组贡粒并确定出酶切位点的位置. 结果lPRV闽 A基 因文库的构 建PRV闺 A经BamH I 酶 解后 , 以质 粒pBR3