PDF《报道以 质粒p》

2 2作 载体 , 经鸟枪 法以T4DNA连接 酶连 接后 , 转化 . D H 以At n p和Tet琼脂平板 筛选 出Amp r 和Te的阳性 重组体 , 重 组质粒酶切l 泳初步筛选 , 然后用 光生物索标记后与经 S o u t h e r n转移 至硝基纤 维索膜上的 P R V脚A/ B a mHI片段进 行杂交鉴定( 杂交结果 见表

1 ) . 克隆出了 P RV固 A基 因组除BamH I― l , 2片 段外 的 所有 】 2个酶 切 片段 的重组质粒,从而构建了PRV闺A的 基 困文 库(见图1).2PRV闽 A株物 理图谱的 确定 以 克隆出的 B a mH I片段 和PN3 H B片段 用 光生物 索标记 作探 针,以Kp n I消化的PRV刚 A 片段作 为杂交的受体 , 以Sou t he r n b l o t 法进 行转膜杂交(杂交结果 见同 2和表

1 ) 据 各杂交片段 之问的邻近关 系和交 替重 叠现象 , 排列出了PRV闽A的BamH I和KpnI的大 部分 限制 性 内切 酶的 位点同 , 即物理图谱(见罔3)讨论本研究不但较 完 整地 克隆出了 P RV 闽A基因组的B丑mH I酶切的14个 片段 中的 I 2个基 因 片段 , 构建 了其基 因文库 , 上土确定出了 P R V 闺ABamHI和 K p n I 的大部分 限制性酶切位点的位置 . 据 已构建的其它 P R V毒寰1以l-lamHI 片段和 P N~ H I t 片段作为探针的杂交结果 Ta b .1

1 - l , t i d i z a t i ~1wn h t a b c l c d l - l a n d - I h

1 a1 a n b d PN~ HI I f t a g mc l l l 生物寮 标记探针 田 A株 D N A爵切 片段 B i o t h

1 . d 耐Rc 灯id妇 I[ r a g mc n ~ t ML n ― A DNA D n I t a mH

1 t K , m 株 的物理 图谱石 出[ , 各PEV基因组 的长链 区(u)变化不大 . 差 异主要是 在重复 区(TR和 I R) 和 短链 区(us ) 以及 它们的连 接,上土大部分对 P R V生 物学 特性较重要的基 因(如主要的糖蛋白基因 g p S

0 ) 位于这 些区域 内.B e t as A等 通过 实验证 实毒 力的标记 也主要 位于这 些 区域 内[ . 因_ 未克隆到两个大片段 , 在确定 P R V 的限制性 内切酶位 点时我们主要 确定了 U s 和重复 维普资讯 http://www.cqvip.com 第4期汪铭书等 : 伪狂犬病毒闽 A株基因文库的构建及物理图谱分析

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9 区的位 点位置 . 从现 已构建的 NI A-

3 、 K a 、 M K一25等毒株的物理 图谱 来看 [

2 . …, 各毒株的酶切位 点的差异又主要是

5 、

6 、

1 4和15这 d个 片段的位置变化 , 在确定『 捌A株的限翻性 酶切位点中 , 困片段 5和 6的迁移率相 同,而大 部分毒株的 5片段位于重复区内 , 因而我 们主张把 闺 A株重 复区 内的 片段编为

5 , 而 片段 6编在长链区内. 片段

1 4在 片段 6和 8之闷 } 片段

1 5的位置是 在 9与

1 l问还是 在3与d同 , 尚待进一步确 定. P RV闽 A株基 因文库 的构建及限制性 内切酶位 点的确定对于探入研 究PRV的分子生 物 学特性和 伪狂犬病 的诊 断、预防有其实际意义和价值 .如现用核 酸探 针杂文技 术诊 断 伪狂犬 病,但用整个基 因组作 探针 , 不但灵敏度和特 异性可能降低 , 且提 取病 毒DNA也较麻烦 , 若用基因文库 中的某个特异性的短 片段则可克服上述 问题C .又如 , 甩国 内PRV毒株构建 基因缺 失苗 , 要切 除编码 毒力 的某 个基 因或加上某 些基 因 片段 , 也须 在克 隆出酶 切 片段并 确定其 酶 切位 点的基 础上进 行.再如,有的学者试 图利用 P R V构 建通 用载体 , 这也 须在克隆 出酶切 片段、了解限制制性 内切 酶位 点的基 础上进行 .此外,我们要对 P R V作进一步深入 的研 究,确定 某个基因编码 区与 P R V所表现 出的生 物学特性之州的关系等也须在克隆出基 因 片段 , 清楚 其 酶切位点 的基 础一 卜进行 . 当然 , 这 些工作还 有待 于去研究 , 但对 我国 P R V闺 A株基 因文库 的构 建及 主要 限制性 内切 酶位点 的确 定,将胄助 于推动我囤基 因工程 技术在 伪狂炎病 诊断 、 预防等方面的实际应用和 发展.圈1克隆的 P R V砑ADNA/IkmlHj片段 和病 毒DNA经 B a m H I 捎他后 在0.7琼脂糖 鹾畦 电溶 J 8小~ q ( S