PDF《鉴定和表达》

6 孔培养板.随机 将其分为空白对照组, 实验组

1 至4, 及阴性对照组. 每孔加入

4 μg 质粒,

10 μl 脂质体.转染

6 h 后, 更换 为含15%胎牛血清无抗生素的培养基, 转染48 h后加 入600 mg/L G418筛选, 经14 d后形成阳性克隆. 1.2.4 RT-PCR 检测 AMPKα2 mRNA 的表达 采用 Trizol 法提取各组细胞总 RNA, 各组取等量的 RNA 进行逆转录反应.逆转录产物 cDNA 用于 PCR 反应, 反应条件: 95℃预变性2 min, 94℃变性30 s, 56℃ 退火

45 s, 72℃延伸

45 s, 终末延伸

7 min, 共30 个循 环.AMPKα2 上游引物序列:5'

-AGCATGGAC- GGGTTGAAGAG-3'

,下游引物:5'

-GTGGCGA- CAGAACGAT TGAG-3'

, 产物长度为409 bp.β-actin 上游引物:5'

-GGGACCTGACTGACTACCTC-3'

, 下 游引物: 5'

-ACTCGTCATACTCCTGCTTG-3'

, 产物长 度为546 bp.PCR产物经琼脂糖电泳分析. 1.2.5 Western blot 检测 AMPKα2 蛋白表达 提取细 胞总蛋白,Bradford 法定量后取50 μg 蛋白用于SDS-PAGE 电泳, 电泳完毕后, 以300 mA、

60 min 转 移至 PVDF 膜上, 5%脱脂牛奶封闭

1 h, 1:500 一抗 4℃过夜, 1:1

000 二抗

1 h, ECL 化学发光剂观察结 果.试验重复

3 次.采用 quantity one 图像分析软件 分析各组蛋白条带的光密度值. 1.2.6 统计学分析 计量资料以 x±s 表示, 采用 SPSS 13.0 统计软件分析.光密度值采用完全随机单因素 方差分析, 组间比较采用LSD法.

2 结果 2.

1 重组质粒的鉴定 重组质粒用 BamH I、 Pst I 分别单酶切鉴定.质粒pGPU6/GFP/Neo 的BamH I 和Bbs I 酶切位点之间 是Pst I的酶切位点.而插入目的基因片段之后, Pst I 酶切位点被取代, 故不能被 Pst I 酶切开.重组质粒 卢俊, 等.人单磷酸腺苷激活的蛋白激酶催化亚单位α2基因shRNA载体的鉴定和表达 第1期・・87 被BamH I单酶切而线性化, 条带在5200 bp左右.酶 切结果表明, 所有质粒均为重组质粒载体(图1).重 组质粒分别命名为 pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα 2(1)-(4)和pGPU6/GFP/Neo NC. 2.2 重组质粒对AMPKα2 mRNA表达水平的影响 将构建好的重组质粒 pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(1)-(4)和pGPU6/GFP/Neo-shRNA NC 分别 转染SH-SY5Y细胞, 并于筛选出阳性克隆细胞后, 提 取各组细胞总 RNA, 经RT-PCR 扩增 AMPKα2 片段, PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳, 结果显示重组质 粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(3) 转染组的AMPKα2 mRNA表达水平明显低于未转染组和阴性 质粒对照组(P0.05). 2.3 重组质粒对AMPKα2蛋白表达水平的影响 重组质粒转染并筛选后, 提取各组细胞总蛋白, 行Western blot 检测,结果重组质粒pGPU6/GFP/ Neo-shRNA AMPKα2(1)、 pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(2)、 pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(4)转 染组的AMPKα2蛋白表达水平与未转染组和阴性质 粒对照组相比无显著差异(P>

0.05), 重组质粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2(3) 转染组的AMPKα2蛋白表达水平明显低于未转染组和阴性质 粒对照组(P........