PDF《构建重组表达质粒 pBV220/mhNT-4》

第1卷第4期2006 年11 月263 中国科技论文在线 SCIENCEPAPER ONLINE 基金项目:首都医学发展科研基金(2002-1014) ,美国中华医学基金(No.

82413) 作者简介:张华,医学博士,眼科博士后,副主任医师,副教授. E-mail:[email protected] 构建重组表达质粒 pBV220/mhNT-4 及mhNT-4 在大肠杆菌中的表达 张华1 ,赵家良1 ,胡海涛2 (1.中国医学科学院北京协和医院眼科,北京 100730;

2.西安交通大学医学院神经生物学中心,西安 710061) 摘要:利用基因重组技术将 mhNT-4 亚克隆到表达载体 pBV220,构建重组表达质粒 pBV220/mhNT-4,诱导 表达 mhNT-4 成熟蛋白, 鉴定 mhNT-4 的生物活性. 将经鉴定的 pGEM-T Easy /mhNT-4 克隆用限制性内切酶 EcoR I,BamH I 消化, 琼脂糖凝胶电泳回收片断. 酶切原核高表达载体 pBV220, 用限制性内切酶 EcoR I,BamH I 消化, 琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体.用T4 DNA 连接酶连结两个回收片断,构建重组质粒 pBV220/mhNT-4.限 制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒.经鉴定的重组质粒 pBV220/mhNT-4 转染大肠杆菌 DH5α, 温度诱导表达 mhNT-4 蛋白.SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳技术分离表达的 mhNT-4 蛋白.制备 8~9d 鸡胚, 分离并培养背根神经节(DRG)细胞. 分别加入回收的表达蛋白和牛血清白蛋白, 培养鸡胚背根神经节 DRG 细胞,检测 mhNT-4 生物活性.重组表达质粒 pBV220/mhNT-4 构建正确,表达框架未发生改变.成功诱导表 达、分离了 mhNT-4 成熟蛋白.表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织快周缘向四周呈放射状长出,对照 组未见神经突起长出. mhNT-4 成熟蛋白具有良好的生物活性. 本研究为进一步开展 mhNT-4 基因治疗青光眼提 供了资料. 关键词:人神经营养素-4 成熟蛋白基因(mhNT-4) ;

基因重组;

表达载体;

生物活性 中图分类号:R96 文献标识码:A 文章编号:1673C7180(2006)04C0263C6 青光眼是一种严重的致盲性眼病,是一组与视 野缺损有关的具有特征性视神经病变的眼部疾病, 以高眼压为危险因素之一.青光眼的视神经病变和 视野缺损,与视网膜神经节细胞及其轴突在视网膜 和视神经缺损相关,阐明视网膜神经节细胞死亡过 程中的细胞分子变化是目前一个活跃的研究领域, 正被广泛应用于视网膜神经节细胞衰亡的机制研究 中,并将为青光眼治疗带来新方法. 神经营养素家族(neurotrophin family)是神经 营养因子中一组形态和结构密切相关的蛋白质[1] , 包 括神经生长因子(NGF) ,脑源性神经营养因子 (BDNF) ,神经营养因子-3(NT-3) ,神经营养因子 -4/5(NT-4/5)和神经营养因子-6(NT-6)[2-6] .对脊 椎动物神经元的存活具有促进作用[7] . 目前, 神经营 养素家族已经成为神经系统研究的热点之一. 在以前的研究中, 我们课题组已成功地从中国人 白细胞中克隆NT-4 全长基因[8] 和成熟蛋白基因[9] .本 文从中国人白细胞中成功地克隆人神经营养素-4 成熟蛋白基因(the matured human neurotrophin-4, mhNT-4)并成功构建重组了真核表达质粒pBV220/ mhNT-4,为今后研究在原核细胞中的表达,进一步 开展青光眼基因治疗创造有利条件[7,10-11] .

1 材料和方法 1.1 载体与菌株 噬菌体载体pGEM-T Easy(50ng/ μ l), 购自Promega公司.重组质粒pGEM-T Easy/ mhNT-4,由 作者构建成功[9] .原核高表达质粒pBV220,见图 1;

宿主菌E coli DH5α由西安华广生物工程公司馈赠. 1.2 工具酶和实验试剂 限制性内切酶EcoR I, BamH I, Sma I, 第1卷第4期2006 年11 月264 构建重组表达质粒 pBV220/mhNT-4 及mhNT-4 在大肠杆菌中的表达 TaqDNA 聚合酶,T4 DNA 连接酶, 考马斯亮兰 R-250 染色, 牛血清白蛋白和淋巴细胞分离液等均购自西 安华美生物工程公司.其它试剂及全部实验设备均 由西安华广生物工程公司提供. 图1pBV220 的限制性内切酶图谱 Fig.1 Restriction map of plasmid pBV220 1.3 感受态细胞制备(CaCI2) 接种 0.1ml E coli DH5α菌种入 10mlLB培养液 中.37℃剧烈振摇(摇床速度 3000r/min)2~3 h (OD600 约为 0.4) .超净台取菌液 1.5ml 入无菌离 心管,8000r/min离心 5min. (以下各步均在无菌条 件下) ;