PDF《构建重组表达质粒 pBV220/mhNT-4》

打开离心管, 弃上清, 加入 0.5ml预冷的CaCI2 重悬菌液.8000r/min离心 5min后,弃上清,再加入 0.1ml预冷的CaCI2重悬菌液,4℃保存. 1.4 琼脂平板的制备 LB 液体培养基的配制: 胰蛋白胨 10g, 酵母提取物 5g, 琼脂 15g, 双蒸馏水定容至 1000ml, 5mol/L NaOH 调定pH至7.0. 分装至

10 个十个烧瓶中, 1.034*105 Pa 高压灭菌 20min后, 保存备用. 在培养皿内加入氨苄 青霉素(50?g/ml) ,再加入适量在微波炉内熔化的 固体培养基, 混匀. 在凝固好的琼脂平板的表面 40?l X-gal,4?l IPTG,用无菌玻璃涂布器涂匀,置37℃ 温箱内 4h. 1.5 制备带有相同粘性末端的载体和目的基因 质粒 pGEM CT Easy/mhNT-4 经限制性内切酶 EcoR I 与BamH I 联合消化后,用1% 琼脂糖凝胶 电泳法回收 0.406Kb mhNT-4 的基因片段. 同样方法 回收经 EcoR I 与BamH I 联合酶切的 pBV220 载体 (3.656Kb). 1.6 带有相同粘性末端的载体和目的基因的连接反 应 建立如下连接反应体系pBV220/EcoR I BamH I (0.1?g/?l) 1?l,mhNT-4/EcoR I BamH I(0.1?g/?l) 1?l,T4 DNA 连接酶(3U/?l) 1?l,10*T4 DNA 连接 酶缓冲液 1?l,H2O 6?l,65℃水浴 5min后,立即冰 浴2min.4℃过夜.在一个 0.5ml 离心管内加入连 接反应体系的目的基因、水和载体,65℃ 5min后, 立即冰浴

2 min. 在连接反应体系加入T4 DNA 连接 酶及 2*T4 DNA 连接酶缓冲液,4℃过夜. 1.7 阳性克隆筛选和鉴定 用连接反应产物转染CaCI2法制备的感受菌E coli DH5α,涂于LB琼脂平板上(Ap+)表面,37 ℃温箱孵育 12h.随机挑选单菌落,种植于含有氨 苄青霉素(200mg/L)的LB培养液内,30℃增殖培 养后,碱裂解法小提质粒,用限制性内切酶EcoR I 和BamH I联合酶切,筛选出含有的 0.406Kb重组质 粒pBV220/mhNT-4 , 再用Sma I 酶切鉴定pBV220/mhNT-4. 1.8 克隆基因的诱导表达 将重组表达质粒 pBV220/mhNT-4 的E. coli DH5 α种植在含有氨苄青霉素(200mg/L)的200ml LB 培 养液内,在30℃振摇培养,使培养液的 OD600 达0.4-0.6,迅速升温至 42℃,继续培养 5h. 1.9 表达蛋白的制备 1.9.1 细菌的裂解(超声破碎法) 将经诱导表达的培养液,在4℃以15000r/min 离心15min 后,弃上清.沉淀用裂解缓冲液(50mmol/L NaAc,150mmol/L NaCI;

pH 5.0) 洗一次, 在4℃以15000r/min 离心 15min 后, 弃上清. 用30ml 裂解缓冲液重悬沉淀,置-20℃,6h.在冰浴条件下, 用超声波细胞粉碎机裂解细菌;

参数:功率 120W, 每次超声粉碎持续 30s,间隔 30s,共6次;

再冰浴 5min;

4℃ 15000r/min,离心 15min,分别收集上清和 沉淀. 1.9.2 包涵体的溶解和蛋白复性 用洗涤液(100 裂解缓冲液;

现配)重悬沉淀, 冰浴

30 后,4℃

15 000r/min,离心 15min,弃上清. 沉淀溶于 8mol/L 尿素中,室温 16h,使其充分溶解, 4℃

15 000r/min,离心 15min,收集上清.上清分别 装于透析袋内,4℃在洗涤液内透析 48h.收集透析 袋内溶液, 4℃

15 000r/min, 离心 15min, 收集上清. 1.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色 第1卷第4期2006 年11 月265 中国科技论文在线 SCIENCEPAPER ONLINE 从电泳装置上取下凝胶,浸于

5 倍体积考马斯 亮蓝染液(0.25g 考马斯亮蓝,90ml 甲醇:H2O(1:1V/V),10ml冰醋酸)内,室温 6h.回收 染液,凝胶用甲醇/醋酸溶液脱色 12h,其间更换脱 色液数次.分析电泳结果,并用 20%甘油溶液保存 凝胶,以备摄影. 1.11 鸡胚背根神经节组织培养 在超净台内,自气室打开 37℃孵育 10........