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1 /Galectin2

3 shRNA 表达载体顺势转 染lovo细胞

72 h后检测转染效率及 Galectin2 3在mRNA和蛋 白水平的表达情况 , 免疫荧光检测转染效率为 62%. 转染 PRNAT2 U6.

1 /Galectin2

3 shRNA的lovo细胞 Galectin2 3的表达 在mRNA和蛋白水平均明显下降 ,各组间比较 F = 2. 214, 148. 566, P = 0. 000, 0. 000,阴性组和阳性对照组相比 , P = 0. 448, 0. 263. 干扰后细胞继续生长 ,与干扰前相比 ,生长明显 减慢 , F = 20. 830, P = 0. 000, 组间比较 F = 149. 710, P = 0. 000, shRNA干扰组与阴性组和阳性组比较 , P = 0. 000, 0. 000. ??: 成功构建 Galectin2

3 shRNA 表达载体 ,干扰后 Galectin2 3在mRNA 和蛋白水平的表达明显降低 , Galectin2

3 表达的抑制可能会导致大肠癌细胞 lovo增殖率的降低. }???~半乳糖凝集素 3;

短发夹 RNA ;

细胞增殖 }?????~R329.

25 }?????~A

0 ?? 大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一 ,其发病年 轻化、 瘤体增长快、 死亡率高的特点成为学者们关注 和研究的锲入点. 干扰技术能有效的敲除基因的表 达 ,目前已被运用到基因的生物学研究中. Galectin2

3 是动物血凝素 Lectin家族成员之一 ,是目前认为与大 肠癌发展关系比较密切的基因 [

1 ] ,在大肠癌中的研 究还少有报道. 本试验我们拟构建 Galectin2 3短发夹 干扰载体 ,从负向角度来研究 Galectin2 3与大肠癌增 殖的关系 ,以望对今后研究 Galectin2 3在大肠癌中的 生物学作用奠定基础.

4 1

0 1 第四军医大学学报 (J Fourth M ilMed Univ) 2007,

28 (11) http: / / journal . fmmu. edu. cn ? 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net

1 ????????? 1.

1 ?? Lovo细胞株来自 ATCC (美国组织培养 保藏中心 ) ,由中国科学院上海细胞生物学研究所提 供 ,病理分期为 Dukeπ s D 期. Lipofectam ine

2000 T M ( Invintrogen,美国 ) Opti2 MEN I( Gibco,美国 ). 蛋白 裂解液 (碧云天 , 中国 ) ;

半干电转仪 (B io2 Rad, 美国),PVDF 膜(B io2 Rad,美国 ) , ECL 化学发光试剂 盒(Phar macia,美国 ) ;

Galectin2

3 人抗大鼠 ( Santa, Crzu) ;

羊抗大鼠 IgG2HRP (博士德 ,中国 ) ;

BCA试剂 盒和预染蛋白质 Marker (碧云天 , 中国 ). MTT和DMSO溶液 (威佳 ,广州 ) ,酶标仪. Trizol和RT2PCR 试剂盒 ( TAKARA 日本 ) , DNAmaker (天为时代 中国),20 g/L,琼脂糖 ( Sigma, 美国 ) , pRNAT2 U6. 1真 核干扰载体 (上海吉码生物公司 中国 ). T4 DNA 连 接酶 ( TAKARA 日本 ). 各种工具酶 ( Takara公司 ) 质粒小提试剂盒 (Q iagen德国 ). 1.

2 ???? 1. 2.

1 细胞培养 37℃,

50 mL /L CO2 条件下 ,培养 于含

10 mL /L 新生牛血清、

1 *

10 5 U /L 青霉素、

100 mg/L链霉素的 RP M I2 1640中 ,根据生长情况传代. 1. 2.

2 构建两条 pRNAT2 U6.

1 Galectin2

3 shRNA 根据 NM2 002306中Galectin2 3编码区序列 ,由上海博 亚基因技术有限公司合成两条 Galectin2

3 shRNAg短 发夹状结构 , ① sense: 5′ 2GATCCCGCATGGAGCAC2 CTGGAGCTTATCC TTCAAGAGAGGATAAGCTCCAG2 GTGCTCCATGTTTTTTGGAAA2 3′ , anti2sense: 3′ 2GG2 CGTACCTCGTGGACCTCGAATAGGAAGTTCTCTCCT2 ATTCGAGGTCCACGAGGTAC AAAAAACCTTTTCGA2 5′ . ② sense: 5′ 2GATCCCGACCTCACCAGTGCTTCAT2 ATTTCAAGAGAATATGAAGCACTGGTGAGGTTTTTT2 TGGAAA2 3′ , anti2sense: 3′ 2GGCTGGAGTGGTCACG2 AAGTATA AAGTTCTCTTATACTTCGTGACCACTCCA AAAAAACCTTTTCGA2 5′ . 1. 2.

3 重组质粒构建与鉴定过程 ① B am H Ⅰ, EcoRⅠ 双酶切 pRNAT2 U6. 1,