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10 g/L 琼脂糖凝胶电 泳分离 ,以凝胶纯化试剂盒纯化备用. ②退火 :分别 用TE

30 μL 溶解寡核苷酸单链 ,使其浓度为

100 μmol, 两条单链各取 5μL混合 ,经95℃

30 s, 72℃

2 m in, 37℃

2 m in, 25℃

2 m in退火后备用. ③ 连接 : 稀释上述产物至 0. 5μmol,按以下体系操作 :将纯化 的质粒片段 2μL, 退火产物 1μL,

10 * T4 DNA Lig2 ase buffer 1. 5μL, BSA (10 g/ L) 0. 5μL, T4 DNA Ligase 0. 5μL, H2 O 9. 5μL,总体积 15μL, 4℃ 过夜 连接. 转化 : 10μL连接产物直接加入感受态细胞

50 μL中 ,轻轻混匀 ,冰上放置

30 m in, 42℃水浴

90 s, 置冰上

2 m in,加800μL LB 培养液 , 37℃

300 r/m in,

60 m in摇匀 ;

取100μL菌液涂匀于氨卞酶素抗性的 固体培养基 ,普通培养箱 37℃ 培养 12~14 h,见培养 皿中长出菌落 ,挑取菌落 3~4个分别放入

5 mL LB + 5μL Amp,

180 r/ m in, 37℃ 过夜 ,观察培养液变 混浊 ,取500μL菌液按照质粒小量快速提取说明书 操作. 提取的重组质粒行双酶切鉴定 ,将连接成功的 质粒样本根据插入片段不同命名为 pRNAT2 U6.

1 ga2 lectin2 3s shRNA1 和pRNAT2 U6.

1 galectin2

3 shRNA2 送测序. 1. 2.

4 转染 参照 L ipofectam ine

2000 T M 产品操作说 明书进行. 调整细胞密度达到 90%左右 , 分别混合 L ipofectam ine

2000 T M

10 μL 与Opti2 MEN I

240 μL, Galectin2

3 shRNA 10μL与Opti2 MEN I 240μL, 室温 静置

5 m in,混合上述两组液体室温静置

20 m in. 每 孔对应加入

500 μL 转染混合液 ,轻摇混匀. 置于 37℃,

50 mL /L CO2 、 饱和湿度的培养箱中培养

6 h后 更换无抗生素的含

100 mL /L小牛血清的 PRM I

1640 培养液 ,

72 h后免疫荧光检测转染效率. 1. 2.

5 W estern2 B lot验证干扰效果 蛋白提取及 W estern B lot,在室温下用

1 *PBS冲洗 lovo 细胞

3 次 ,收集细胞.

5000 r/m in 离心后加入蛋白裂解液 200μL........