PDF《GV3101 Chemically Competent Cell 产》

GV3101 Chemically Competent Cell 产品说明书 产品规格(CAT#:AC1001) GV3101 Competent Cell 100μl /支pCAMBIA2301 (control vector, 10ng/μl) 10μl 保存条件(保质期) : -80℃(12 个月) 基因型 C58 (rifR ) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR ) Nopaline 产品说明 GV3101 菌株为 C58 型背景,核基因中含有筛选标签――利福平抗性基因 rif,为了便于转化操作,此菌 株携带一无自身转运功能的胭脂碱型 Ti 质粒 pMP90 (pTiC58DT-DNA),此质粒含有 vir 基因 (vir 基因是 T-DNA 插入植物基因组必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的 T-DNA 转移功能被破坏,但 可以帮助转入的双元载体 T-DNA 顺利转移).

pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 质粒含有筛选标签:gent, 赋予 GV3101 菌株庆大霉素抗性,适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作.本公司生产 的GV3101 化学转化感受态细胞经特殊工艺制作,pCAMBIA2301 质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA. 常规操作方法 1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化,处于冰水混合状态时插入冰中. 2. 每100 μl 感受态加入 0.01-1 μg 质粒 DNA(转化效率较高,第一次使用前最好做预实验确定所加质 粒的量) ,用手拨打管底混匀,依次于冰上静置

5 分钟、液氮

5 分钟、37℃水浴

5 分钟、冰浴

5 分钟. 3. 加入

700 μl 无抗生素的 LB 或YEB 液体培养基,于28℃振荡培养 2~3 小时. 4.

6000 rpm 离心一分钟收菌,留取

100 μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的 LB 或YEB 平板上,倒置放于 28℃培养箱培养 2-3 天 (当平板只含有

50 μg/ml kan 时,28℃培养

48 h 即可;

平板中同时加入

50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 时,需28℃培养

60 h;

如果使用的平板含有

50 μg/ml rif 则需要 28℃培养 72-90 h) . 农杆菌相关抗生素配方: 抗生素 配方 原液 工作液 羧苄青霉素 (carb) 双蒸水溶解,0.22 μm 滤膜过滤除菌

50 mg/ml

50 μg/ml 硫酸卡那霉素 (kan) 双蒸水溶解,0.22 μm 滤膜过滤除菌

50 mg/ml

50 μg/ml 链霉素 (strep) 双蒸水溶解,0.22 μm 滤膜过滤除菌

10 mg/ml

50 μg/ml 利福平 (rif) DMSO 溶解,0.22 μm 滤膜过滤除菌

10 mg/ml

20 μg/ml 庆大霉素 (gent) 双蒸水溶解,0.22 μm 滤膜过滤除菌

20 mg/ml

40 μg/ml 常用农杆菌抗性: (R:抗;

S:敏感.) 农杆菌菌株 羧苄青霉素 (carb) 链霉素 (strep) 利福平 (rif) 庆大霉素 (gent) 硫酸卡那霉素 (kan) AGL-1 R S R S S EHA101 S S R S R EHA105 S S R S S LBA4404 S R R S S GV3101 S S R R S LB 及YEB 配方: Component LB(液体)/L LB(固体)/L component YEB(液体)/L YEB(固体)/L Tryptone

10 g

10 g Tryptone

5 g

5 g Yeast extract

5 g

5 g Yeast extract

1 g

1 g NaCl

10 g

10 g 牛肉浸膏

5 g

5 g NaOH 调PH 到7.0 调PH 到7.0 蔗糖

5 g

5 g Agar -

15 g MgSO4*7H2O 0.49 g 0.49 g NaOH 调PH 到7.0 调PH 到7.0 Agar -

15 g 注意事项 1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的 1/10;

质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;

质粒增大一 倍,转化效率下降一个数量级. 2. 混入质粒时应轻柔操作.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量. 3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量. 4. 利福平浓度不应高于

25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率.本公司 GV3101 感受态计算转化效率时所用平板只含有