PDF《Hieff MutTM》

对质粒模板进行反向扩增;

扩增产物经 DpnI 消化,去除甲基化模板 进行重组环化反应 重组产物直接转化到感受态细胞中 Forward Primer ? Mutation Point Complementary Region Original Vector (Methylated) Complementary Region Linear Amplicon (Non-Methylated) Mutated Vector (Non-Methylated) Mutated Vector (Methylated) 上海翊圣生物科技有限公司 客服热线:400-6111-883 E-mail: [email protected]

网址:www.yeasen.com 第3页,共8页图二:向质粒引入单碱基(或连续多碱基)定点突变引物设计示意图 【注】 :计算引物Tm值时,应计算待突变位点至引物3'

端这一区域内的碱基,调整引物长度使这一段Tm值高于60℃,待突 变位点至引物5'

端区域内的碱基不应参与计算. 2. 目标质粒扩增 2.1 配制PCR反应体系 反应各组分解冻后请充分摇匀,使用完毕后及时放回-20℃.2*Hieff? II PCR buffer请勿长时间敞口放置. 为了增加扩增特异性,反应体系配制过程请于冰水浴中进行.为了防止Hieff? II Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引 物,请将聚合酶最后加入反应体系中. ddH2O Up to

50 μl 2*Hieff? II PCR buffer

25 μl dNTP Mix (10 mM each) a

1 μl 模板DNA b Optional 引物1 (10 μM)

2 μl 引物2 (10 μM)

2 μl Hieff? II Pfu DNA Polymerase (1 U/μl) c

1 μl a. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板. b. 在质粒能正常扩增的前提下,应尽量减少质粒模板使用量,推荐使用≤1 ng新鲜提取的质粒做模板. c. 推荐的酶的终浓度为1 U/50 μl反应. 可将Hieff? II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之间进行优化, 但不要超过2 U/50 μl, 尤其当扩增子长度大于5 kb时. 2.2 PCR扩增反应 推荐PCR反应条件: 循环步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃

30 sec

1 变性a 退火b 延伸c 95℃ 60℃~72℃ 72℃

15 sec

15 sec 30-60 sec/kb

30 d 彻底延伸 72℃

5 min

1 a. 对于大多数质粒,变性温度使用95℃即可. Mutation Point pUC18 21bp Complementary Region Non-complementary Region 5'

――GCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAA――3'

3'

――CGGATAAAAATATCCAATTACAGTACTATTATTACCAAAGAATCTGCAGTCCACCGTGAAAAGCCCCTTTACACGCGCCTT――5'

Non-complementary Region 21bp Complementary Region 21bp Complementary Region Non-complementary Region 5'

――TAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG――3'

3'

――TATCCAATTACAGTACTATTATTACCAAAGAATCTGCAGTC――5'

Non-complementary Region 21bp Complementary Region 载体正向扩增引物序列为: 载体反向扩增引物序列为: 上海翊圣生物科技有限公司 客服热线:400-6111-883 E-mail: [email protected]

网址:www.yeasen.com 第4页,共8页b. Hieff? II Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火.一般来说,退火温度设置为引物Tm值即可.如果需要,可以 建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度.退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状. c. 对于大多数扩增反应,延伸过程可在72℃进行.长的延伸时间有助于提高扩增产量. d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变,强烈建议扩增循环数≤35.如果扩增效率良好的话,推荐扩增循环数≤30. 反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测.如目标质粒正确扩增,则可进行下步实验. 3. 扩增产物 DpnI 消化,去除甲基化模板质粒 因上述扩增产物中包含原始模板质粒, 为防止其在转化后形成假阳性转化子, 必须在进行重组环化之前进行DpnI消化. 推荐反应体系如下: DpnI