PDF《胞中的表达1》

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1 - 重组载体 pEGFP-N1/TNFR

1 在人脐静脉血管内皮细 胞中的表达1 叶顺传,曾秋棠,吴辉文,吕云波 华中科技大学同济医学院协和医院心研所,湖北武汉(430022) E-mail:[email protected] 摘要:目的:构建肿瘤坏死因子受体(TNFR 1)绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP-N1/TNFR 1,并在人脐静脉血管内皮细胞中表达.方法:分离并培养 HUVEC,将已成功构建的融合 表达载体 pEGFP-N1/TNFR 1(另文发表),通过阳离子脂质体 Lipofectin 介导的方法转染到 HUVEC 中,RT-PCR 检测 mRNA 的表达,Western blot 检测融合蛋白的瞬时表达,同时在 在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察.结果:成功分离人脐静脉血管内皮细胞,重组 pEGFP-N1/TNFR

1 融合表达载体转染 HUVEC 细胞后,在细胞中检测到 TNFR

1 基因片段, Western blot 可以检测到 TNFR

1 在HUVEC 细胞表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有 绿色荧光蛋白表达. 结论: 重组 pEGFP-N1/TNFR

1 融合表达载体在 HUVEC 中获得了表达, 融合蛋白具有 TNFR

1 和GFP 的双重活性,为进一步研究 TNFR 转位的调控因素打下基础. 关键词:TNFR 1;

绿色荧光蛋白;

人脐静脉血管内皮细胞;

克隆 近年的研究表明,肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)在心血管疾病,如高血 脂、高血压和动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)等的病理生理过程中起着重要的介质作 用[1] . 研究肿瘤坏死因子受体(TNF receptor,TNFR)是揭示TN F作用机理的重要途径.在TNF的刺激下,TNFR 1可能从反式高尔基体转位到细胞膜,但是,TNFR 1细胞内转位通路 及调节因子尚不明确[2] . 本实验在已构建绿色荧光蛋白融合TNFR 1基因的重组载体pEGFP-N1/TNFR 1的基础 上,拟转染人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),观察 其表达,为进一步研究TNFR 1细胞内转位通路及调节因子奠定基础,并为阐明TNF引起的 细胞损伤机制提供实验依据. 1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂 Trizol 试剂、 Lipofectin 脂质体、 OPTI-MEM I 无血清培养基购自 Invitrogen 公司. RT-PCR 试剂盒购自大连宝生物.PCR 产物纯化试剂盒购自 Promega 公司.质粒抽提试剂盒、DNA marker 购自北京天根生化.T4 DNA 连接酶、限制性内切酶 Kpn I、Sac I 购自 NEB 公司.I 型胶原酶购自 Sigma,内皮细胞培养液(含ECGs、胎牛血清、青/链霉素)购自 ScienCellTM 研究实验室. 国产胎牛血清购自杭州四季青. RPMI

1640 培养基购自 Hyclone 公司.vWF 因子抗体为武汉博士德公司产品.兔抗人 TNFR

1 多克隆抗体、辣根过氧化物酶 (HSP)标记的山羊抗兔 IgG 购自 Santa Cruz.ECL 检测试剂盒购自 Pierce 公司.引物 的合成和序列测定由上海生工完成.

1 本课题得到教育部博士点专项基金资助项目(20040487067)的资助. http://www.paper.edu.cn -

2 - 1.1.2 质粒与菌株 重组 pEGFP-N1/TNFR

1 载体在前期实验已成功构建(另文发表) ,质粒 pEGFP-N1 由 华中科技大学同济医学院免疫学国家重点实验室惠赠. 1.2 方法 1.2.1 HUVECs 的分离和培养 按Jaffe 等[3,4]的方法加以改进?脐带取自华中科技大学同济医学院协和医院妇产科, 健 康产妇,剖腹产.在无菌条件下取无扭曲?打折?破损的新生儿脐带,剪去钳痕和凝血块阻塞 部分,

37 PBS ℃ 反复冲洗脐静脉管腔, 排空脐静脉, 注入 37℃预温的 0.1% I 型胶原酶 10ml, 37℃孵育