PDF《胞中的表达1》

10 min. 收集消化液, 加入胎牛血清 2ml 终止酶反应?用PBS 反复冲洗脐静脉管腔, 同消化液一并室温离心,

1 000 r/min 离心

10 min.弃上清,加入内皮细胞培养液(含ECGs, 5% FBS,不含抗生素) ,充分混合制成细胞悬液,转入多聚 L 赖氨酸铺底的细胞培养瓶,37 ℃,

5 %CO2 条件下, 培养

24 h, 使内皮细胞贴壁?第二天更换新鲜培养基 (含ECGs, 5% FBS, 100U/ml 青霉素和 100mg/ml 链霉素) ,每2~3 天更换培养基.用消化液(0.

125 %胰蛋白酶 和0. 01% EDTA)消化传代.转基因前予细胞形态学观察及免疫细胞化学染色( ICC) 鉴定? 倒置显微镜下见细胞呈多角形排列.用Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学方法进行 HUVECs 鉴定. 1.2.2 转染 所有的质粒均用 Lipofectin 转染 HUVEC 细胞,根据试剂提供商的转染方案进行转染. 在脂质体转染前一天,按1*105/ml 密度接种 HUVEC 细胞于

6 孔培养板,添加无抗生素 ECM 培养,生长过夜至细胞铺满 40-60%.转染前,6?l Lipofectin 溶于 100?l 无血清培养基 制成 A 液,室温放置 45min.1.0?g DNA 溶于 100?l 无血清培养基制成 B 液.A 液和 B 液 轻轻混匀,室温孵育 15min.吸弃培养基,用2ml 无血清培养基洗涤细胞一次, 弃去培养基. 加入 0.8 ml 无血清培养基到 A、B 混合液,轻轻混匀,然后加到细胞.37℃、5% CO2 继续 培养

6 小时.加入 2ml 含血清培养基,继续培养.所有的转染实验均重复三次以上.48 小 时后检测转染基因表达. 1.2.3 转染 HUVEC 细胞 RT-PCR 检测 TNFR

1 mRNA 的表达 转染后 48h 分别提取细胞总 RNA,采用 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂,按说明书操作 方法进行, 紫外分光光度计定量后用于反转录. 利用 Takara 公司逆转录试剂盒将总 RNA 反 转录成 cDNA 第一链,随后进行 PCR 扩增.用于检测 TNFR

1 转染入细胞 RT-PCR 引物如 下: 上游引物 5'

-TCC TGG AGC TGT TGG TGG GAA TAT AC-3'

;

下游引物 5'

-TTT TCA GGT GTC GAT TTC CCA CAAACAAT-3'

. PCR 扩增条件:

94 5min ℃ , 首次循环

94 30s ℃ , 60.1℃ 30s,72 1min ℃ ,共30 个循环,最后

72 10 min ℃ ,4

5 min ℃ .PCR 产物经

1 %琼脂糖凝胶 电泳分析结果. 1.2.4 Western blot 检测重组融合蛋白的表达 质粒转染 48h 后,提取重组质粒 pEGFP-N1/TNFR

1 组、空载体 pEGFP-N1 组和空白对 照组细胞的总蛋白.培养细胞用冰预冷的 PBS 洗2次后加入裂解液,冰浴 5min,将裂解物

12 000r/min 离心 10min 后收集上清.Bradford 试剂盒确定蛋白浓度.在10% SDS-PAGE 上http://www.paper.edu.cn -

3 - 进行分离后,电转移至硝酸纤维素膜上.经5%脱脂奶粉封闭后,与一抗室温孵育 1h,再 经洗膜,并与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育,最后经 ECL 发光反应,并曝光于 X 光片上. 1.2.5 荧光显微镜观察 在用重组质粒 pEGFP-N1/TNFR

1 转染 HUVEC 细胞 48h 后,采用倒置荧光显微镜观察 绿色荧光在细胞中的表达情况.用490nm 蓝光激发,确定重组 TNFR 1/EGFP 融合蛋白在细 胞中的表达. 2. 结果 2.1 人脐静脉内皮细胞的培养与观察 在倒置相差显微镜观察可见, 生长融合的内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列, 细胞边界清楚, 胞浆丰富,胞核呈圆形或椭圆形,偶见双核,密集处呈铺路石状镶嵌排列,稀疏处为梭形. 用Ⅷ因子相关抗原进行细胞免疫化学染色, 获取的内皮细胞为棕色, 细胞密集区细胞质呈浅 棕色,密集区边缘和稀疏区的梭形细胞胞质呈深褐色(图1) . 图1 人第Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测胞质内见棕黄色阳性颗粒(*300) 2.2 转染细胞 RT-PCR 结果 质粒转染 48h 后,在重组质粒 pEGFP-N1/TNFR