PDF《原位杂交操作规程》

原位杂交操作规程 检测石蜡包埋组织 mRNA 注意事项: 1.

杂交前和杂交过程中所用物品设备应防止 RNase 污染 2.相关试剂均需用 DEPC 处理过的双蒸水配制(双蒸水中加入 0.1%DEPC,摇动放 置3-4 小时,高压消毒灭活 DEPC 后备用) 3.试剂配制应防止 RNase 污染 相关试剂配置 1. DEPC-PBS(DEPC 处理的磷酸盐缓冲液): 140mMNaCL;

2.7mM KCL;

10mM Na2HPO4;

1.8mM KH2PO4 pH7.4 (用DEPC 处 理的双蒸水配置) 2. TE 缓冲液:10mM Tris, 1mM EDTA,pH8.0 3. 0.1M 三乙醇胺(pH8.0): 三乙醇胺 5.33ml DEPC 处理的双蒸 水定容至 1L 4.

20 SSC 175.3g ;

柠檬酸三钠 88.2g DEPC 处理的双 蒸水定容 1L 5.

100 Denhardt's: Ficoll400 2g;

PVP (聚乙烯吡咯烷酮)2g ;

BSA(小牛血清白蛋白)2g ;

DEPC 处理的双蒸水定容至 100ml 6. 寡核甘酸探针杂交缓冲液: 配制 20ml(20 SSC 4ml ;

硫酸葡 聚糖 4g;

去离子甲酰胺 10ml;

PolyA(10mg/ml) 0.5ml ;

鱼精ssDNA(10mg/ml) 0.5ml;

tRNA(10mg/ml) 0.5ml;

1M 二硫代苏 糖醇(DTT) 2ml;

50 Denhardt's 0.2ml(-20 保存 使用前平衡到

37 7. 缓冲液 A: 100mMTris-HCL(pH7.5);

150mMNaCL 8. 9. 10. 封闭液: 缓冲液 A 中加入 0.1% Triton-X100 和2%正常山羊血清 缓冲液 B: 100mMTris-HCL(pH9.5) ;

100mMNaCL;

50mM MgCL2 缓冲液 C: 10mMTris-HCL(pH8.1) ;

1mM EDTA 程序 1. 二甲苯脱蜡,梯度酒精水化,DEPC 处理的ddH2O 速洗两次,DEPC-PBS(用DEPC 处理过的双蒸水配制的磷酸盐缓冲液)洗25分钟 2. DEPC-PBS 稀释的 0.3%Triton-X100 处理

15 分钟 3. DEPC-PBS 洗25分钟 4. TE 缓冲液稀释的 Rnase-free 蛋白酶 K(蛋白酶 K 用于石蜡切片的 建议浓度为 5-20 g/ml)在37 孵育 10-30 分钟或者 0.2M HCL 稀 释的 0.1%胃蛋白酶(胃蛋白酶用于石蜡切片的建议浓度为 100-500 g/ml)在37 孵育 20-30 分钟(具体孵育时间需自行摸索) 5. 如果用蛋白酶处理,处理后 PBS+2mg/ml 甘氨酸洗

30 秒至

1 分钟, 然后 DEPC-PBS 洗25分钟;

如果用胃蛋百酶处理,处理后 DEPC-PBS 洗25分钟 6. DEPC-PBS 稀释的 4%多聚甲醛后固定 10-15 分钟 7. DEPC-PBS 洗25分钟 8. 0.1M 三乙醇胺稀释的 0.25%醋酸酐孵育

10 分钟(0.1M 三乙醇胺稀 释的 0.25%醋酸酐需在孵育前配置并立即使用且不能二次使用) 9.

2 SSC 洗3分钟 10. 不含探针的寡核甘酸探针杂交缓冲液在

37 孵育

2 小时 11.

2 SSC 洗5分钟 12. 含探针杂交缓冲液在

37 孵育约

18 小时 13.

1 SSC 在室温下速洗,

1 SSC 在55 水浴摇洗

2 15 分钟, 0.5 SSC 在55 水浴摇洗

2 15 分钟, 0.5 SSC 在室温下洗

10 分钟 14.缓冲液 A 摇洗

2 10 分钟 15.室温下封闭液孵育

30 分钟 16.除去封闭液在室温下用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体孵育 2-4 小时(抗体用封闭液稀释) 17.缓冲液 A 洗210 分钟 18.缓冲液 B 室温孵育

10 分钟 19.BCIP/NBT 避光显色 2-24 小时(由于石蜡组织在固定处理制作过程 中难免有 RNA 的降解,我们建议用碱性磷酸酶-BCIP/NBT 显色系 统,因为其敏感性较辣根过氧化物酶-DAB 显色系统更高) 20.缓冲液 C 终止显色,然后浸入蒸馏水 21.核固红套染(可染或不染),水溶性封片剂(water-soluble mounting media)封片,显微镜观察结果. 上海闪晶分子生物科技有限公司 地址:上海市闵行区北桥镇吴河路328号A栋2楼 邮编:201109 联系:市场部

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