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863 高技术研究项目中启动了抗虫转基因棉 花的研究. 经过十多年的努力已在单价抗虫棉的研制及应用方面取得了显著的成 就,实现了产业化生产,据报道,我国抗虫棉审定过的品种已有

14 个,抗虫棉 在我国的种植面积达

2 千多万亩. 因为害虫对两种抗虫蛋白产生抗性的机率要远 远小于仅对一种抗虫蛋白产生抗性的机率. 为了避免或延缓棉铃虫对抗虫棉产生 耐性从 九五 开始开展了转双抗虫基因转基因棉花的研究(即所谓的双价抗虫

5 棉) . 苏云金芽孢杆菌(Bt)为革兰氏阳性细菌,在芽孢生成期可形成一种由杀虫 蛋白前体蛋白组成的伴孢晶,自30 年代发现其对某些昆虫有毒杀作用以来,Bt 制剂已作为一种对人和环境安全的生物杀虫剂在农业、 林业及环境卫生等方面应 用了半个多世纪.Bt 晶体蛋白的杀虫机制主要在于它被敏感昆虫攫取后在昆虫 肠道的碱性条件下(就鳞翅目昆虫而言)溶解产生 130KD 左右的前毒素分子, 经肠道蛋白酶将该前毒素分子的 C 端一半及 N 端一段残基加工去掉后才能最终 形成完全活化的杀虫蛋白(a.et al. Eur.Biochem. 189:523-527, 1990;

)活化的 毒蛋白与敏感昆虫中肠上皮细胞上的受体结合,插入到中肠细胞膜上形成 0.5-1.0nm 的小空或离子通道,引起胞内离子的外渗及水的内渗,结果细胞溶涨 破裂,大量细胞遭到破坏,使幼虫停止进食而死亡.基于上述机制,多数抗虫转 基因植物研究所用的 Bt 基因是 3′端缺失了大约一半的基因片段.结果证明在植 物中 3′端缺失的 Bt 基因比全长的 Bt 基因能更好的表达杀虫蛋白.虽然用缺失 的Bt 基因获得的转基因植物对敏感昆虫有较高的毒杀活性,对特定的植物与目 标昆虫组合有一定的应用价值,但一般来说这种野生型 Bt 晶体蛋白基因在转基 因植物中的表达量是非常低的.在CaMV

35 S 启动子驱动下其表达量约占总可 溶性蛋白的 0.001%左右, 所以不能使转基因植物获得毒杀多数对 Bt 毒蛋白不太 敏感的昆虫,如很多农作物的主要鳞翅目害虫. Fishhoff 等(1987)用不同启动子表达 Bt 基因的结果表明,不同启动子对 Bt 的表达水平影响不大,都不能显著提高 Bt 蛋白的表达量.所以推测 Bt 基因 DNA 序列本身的一些特点可能与低水平表达有关.与高等植物的基因相比,苏 云金芽孢杆菌晶体蛋白基因具有更高的 AT 含量,一般在 60-70%,而植物基因 一般在 55%以下. 这种富含 AT 的特点使 Bt 基因含有许多可能引起其 mRNA 不 稳定的基序如 ATTTA;

潜在的 polyA 信号序列如 AATAAA, AATAAT, AATGAA, AATATT, GATAAA, AACCAA 和ATATAA 等AT-rich 基序,这些基序在一定旁 侧序列环境下在一定的细胞类型中可能引起转录的提前终止, 形成不稳定的, 无 功能的 mRNA. Bt 晶体蛋白基因的碱基组成(~70% AT)与植物的内含子的很相似,所以在

6 植物中可能形成一些隐形内含子,如果存在内含子的 5′GT……AG 3′剪接序列, 则可能在植物中被剪接形成 Bt Cry 基因的缺失或产生无效转录物.Van Aarssen 等在研究 Bt Cry1Ab 基因 在烟草原生质中转录物的组成时发现该基因上存在着 三个可作为内含子的区域,在植物中这三个内含子可被剪接,使CrylAb 基因的 绝大部分转录产物分子量小于全长转录物, 从而大大降低了运送到胞质中的正常 Bt mRNA 的量. 另一个可能影响 Bt Cry 基因表达的因素是这类基因的密码子使用与植物基 因的密码子使用频率很不一致.由于 Bt 基因的 AT 含量很高,其密码子第三位 多为 A/T, 而植物中密码子的第三位多为 G/C,特别是 XTA 和XCG 一类密码子 是植物中非常稀有的,所以 Bt 基因的密码子不易被植物的翻译机器所识别,这 就可能使 Bt mRNA 在植物中翻译效率很低.Hoekema 等在酵母中对异源基因 codon 的突变结果表明翻译效率越高 mRNA 稳定性也越高,反之稳定性越低. 所以不适宜的 Bt 基因密码子不但影响蛋白的翻译而且也影响其 mRNA 的稳定 性. Perlark 等根据植物基因的密码子使用频率及可能影响植物 mRNA 稳定性的 基序在保持原 Bt 基因编码的氨基酸序列不变前提下,对Bt 晶体蛋白基因 Cryl Ab 和CrylAc 进行了部分改造或全部重新合成.部分改造和重新合成的基因在 转基因植物中表达的杀虫蛋白量比野生型基因的表达量分别提高了约十倍和