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1 号楼三层 301-67 号PEG 融合剂(50%PEG1500) 产品编号:8106 50%PEG1500 溶解于 75mM HEPES, pH8.0, 0.2μm 过滤,直接使用. 本产品经小鼠杂交瘤细胞制备测试,用于杂交瘤细胞的制备. 试剂组成和规格 1.0ml/瓶, 10ml/瓶,100ml/瓶 运输、储存和有效期 冷藏运输,-20° C 储存,避光,在有效期内使用. 正常储存条件下自生产之日起有效 期2年. 使用方法 1. 用前从冷冻室取出,置于 15~20℃,或2~8℃过夜融化,混匀.不要置于 37℃水浴融 化. 2. 细胞融合过程中避免使用含血清的培养基 细胞融合步骤 1. 将10

8 脾细胞和 2x10

7 骨髓瘤细胞(分别悬浮在 25ml 杂交瘤

2 号培养基)混合. 2. 1000rpm(200-400g)离心 5-10 分钟. 3. 彻底吸除上清,避免在后面的操作中稀释 PEG. 4. 轻轻敲击试管底部,打散细胞团,将试管放入 37℃水浴中,融合过程在水浴中进行. 5. 用1ml 吸管将 1ml 预热 37℃的50%PEG1500 加入到细胞团中, 边加边用吸管头轻轻搅拌,

1 分钟内加完. 6. 继续搅拌 50%PEG1500 中的细胞 1-2 分钟. 7. 缓慢加 1ml 预热 37℃的杂交瘤

2 号培养基,边加边搅拌,1 分钟内加完. 8. 缓慢加 4ml 预热 37℃的杂交瘤

2 号培养基,边加边搅拌,2 钟内加完. 9. 缓慢加 10ml 预热 37℃的杂交瘤

2 号培养基. 10. 37℃孵育

5 分钟, . 11. 1000rpm(200-400g)离心 5-10 分钟 12. 移去上清,将细胞悬浮于杂交瘤

3 号培养基 10ml 中,用粗口尖吸管轻轻吹散,在37℃ 5%CO2 条件下培养过夜(16~24 小时). 一步法在

96 孔板中进行杂交瘤筛选和克隆 1. 将杂交瘤

4 号培养基 90ml(含HAT 半固体培养基)提前一天在 2~8℃过夜融化. 2. 在细胞融合当天,烈摇动融化的杂交瘤选择培养基并预热到室温. 3. 将10ml 前一天融合的细胞悬液与 90ml 杂交瘤

4 号培养基混合,轻轻翻转细胞瓶

6 次, 静置

15 分钟. 4. 用多通道枪或滴管在

96 孔培养板中每孔加入

100 μl. 5. 在37℃ 5%CO2 二氧化碳培养箱中培养

8 天. 6. 每孔加 150μl 杂交瘤

5 号培养基. 7. 在37℃ 5%CO2 二氧化碳培养箱中再培养 2~4 天. 8. 每孔取 50μl 培养上清,进行抗体检测.阳性孔检查克隆数,含有单个克隆的孔可用弯 头滴管吸取细胞转移到每孔含有 200ul 杂交瘤

5 号培养基的

96 孔板中;

如果含有

2 个或

3 个克隆,且距离足够远,不会互相混合生长,可分别将每个克隆单独转移到每孔含有 200ul 杂交瘤

5 号培养基的

96 孔板中;

如果克隆之间不能分开,需要用传统方法克隆(如有限稀 释法). 北京梅科万德生物科技有限公司 http://www.makewonderbio.com 地址:北京市海淀区清河嘉园东区甲

1 号楼三层 301-67 号 参考文献 1. K? hler G, Milstein C: Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-497, 1975. 2. Harlow E, Lane D: Monoclonal Antibodies, Chapter

6 in: Antibodies, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York: ISBN 0-87969-314-2, 1988. 3. Melchers F, Potter M, Warner NL: Lymphocyte hybridomas. Secondworkshop on "functional properties of tumors of T and B lymphocytes". Preface. Current Topics in Microbiology & Immunology 81: IX-XXIII,

1978 4. Davis JM, Pennington JE, Kubler A-M, Conscience JF: A simple, single-step technique for selecting and cloning hybridomas for the production of monoclonal antibodies. J Immunol Methods 50: 161-171, 1982. 5. Goding JW: Antibody production by hybridomas. [Review]. J Immunol Methods 39: 285-308, 1980. 6. Sharon J, Morrison SL, Kabat EA: Detection of specific hybridoma clones by replica immunoadsorption of their secreted antibodies. Proc NatlAcad Sci(USA) 76: 1420-4, 1979. 7. Pearson TW, Pinder M, Roelants G, Kar S, Lundin L, Mayor-Whithey KS, Hewett RS: Methods for derivation and detection of anti-parasite monoclonal antibodies. J Immunol Methods 34: 141-154, 1980. 8. Kennett RH, McKearn TJ, Bechtol KB: Monoclonal antibodies. Plenum Press, New York, 1980. 9. Coligan JE: Current Protocols in Immunology, Unit 2.5: Production of Monoclonal Ant ibodies. John Wiley & Sons, Inc., USA,