PDF《慢病毒生产及使用操作手册》

慢病毒载体构建及包装操作手册 公司地址: 上海市徐汇区斜土路

1175 号15 楼E-mail:service@hanbio.

net Tel:021-51296258 http://www.hanbio.net 实验室地址:上海市张江高科技园区蔡伦路

720 弄张江药谷孵化器

1 号楼

314 -

36 - 慢病毒生产及使用操作手册

一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒, 三种质粒载体分别进行高纯度无内毒 素抽提,共转染 293T 细胞,转染后

6 h 更换为完全培养基,培养

48 和72h 后,分别收集 富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒.

二、实验材料

(一)慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统,组成为 pspax2, pMD2G, pHBLV TM 系列质粒.

1、载体信息(见附录)

2、细胞株 293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养基为 DMEM(含10% FBS).贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞.

3、菌株 大肠杆菌菌株 DH5α.用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒.

三、包装细胞 293T 细胞的培养

(一) 293T 细胞的冻存 随着传代的次数增加,293T 细胞会出现生长状态下降、突变等.为了防止此类现象的 出现,我们需要在开始就对细胞进行大量冻存,以保证实验的稳定性和持续性.在细胞对数 生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率.

1、去掉上清液,加入 PBS 洗去残留的培养基;

2、加入 0.25%的胰酶,消化 1~2min 后,镜下观察细胞变圆,细胞间间隙加大时,去除 胰酶,加入新鲜培养基吹打混匀,移入离心管中.

3、细胞计数,将细胞全部晃下,加入 3mL

37 ℃ 预热的 10% DMEM,用10mL 移液管 进行吹打,较大力吹打 6~8 次即可,不留死角,之后,将所有细胞吸出,置于 15mL 离心 管中,取50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中,加入450ul 10% DMEM,即为

10 倍稀释,混匀,取10ul 细胞于计数板 中计数.计数板上共

4 大格,每大格

16 小格.计 数时,4 大格均计 数,总数除以 4(得每大格细胞数) ,再乘以 10(10 倍稀释) ,即 为实 慢病毒载体构建及包装操作手册 公司地址: 上海市徐汇区斜土路

1175 号15 楼E-mail:[email protected] Tel:021-51296258 http://www.hanbio.net 实验室地址:上海市张江高科技园区蔡伦路

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37 - 际n万/mL 细胞浓度.

4、细胞离心,1000rpm,5min.去掉上清.

5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液(70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO),重悬细胞, 密度为

3 x

10 6 个/ml.

6、分装进细胞冻存管,放入冻存盒中,放入-80℃超低温冰箱.

7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存,并作记录.保存过程中,要不时复苏细胞检 测细胞存活率,观察细胞状态等.

(二)293T 细胞的传代 当细胞生长到汇合率达到 80%~90%时需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维 持细胞良好的生长状态.

1、消化细胞,方法同细胞冻存.

2、细胞离心结束后,加入完全培养基重悬.

3、根据具体情况,将细胞分到 10cm 培养皿中,每个培养皿补足到 10ml 培养基.

4、将培养皿平稳放回 37℃、5%CO2 和95%相对湿度的培养箱中培养.

(三)293T 细胞的复苏 当细胞传代次数过多,细胞状态变差时,或者细胞出现污染事故时,需要丢弃并对最初 冻存的细胞进行复苏.

1、设置温度为 37~42℃的水浴.

2、查看细胞库记录,根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞(需戴上棉手套,防止被冻 伤) ,迅速丢入水浴锅中并快速晃动,尽量在 1~2min 内使细胞溶液完全溶解.