PDF《慢病毒生产及使用操作手册》

3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中,并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养基,混匀后离 心,1000rpm,5min.

4、去掉上清,加入 5ml 新鲜的完全培养基,混匀沉淀后,转入 6cm 培养皿.

5、将培养皿平稳放入 37℃、5%CO2 和95%相对湿度的培养箱中培养. 慢病毒载体构建及包装操作手册 公司地址: 上海市徐汇区斜土路

1175 号15 楼E-mail:[email protected] Tel:021-51296258 http://www.hanbio.net 实验室地址:上海市张江高科技园区蔡伦路

720 弄张江药谷孵化器

1 号楼

314 -

38 -

6、第二天观察细胞存活率.给细胞换一下培养基.以后每天观察细胞生长情况.

四、慢病毒包装和浓缩

(一)质粒扩增 构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提,浓度大于 1ug/ul,A260/280 在1.7-1.8 间方可用以包毒.推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提.

(二)传293T 细胞 将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净,加入 2mL

4 度冰箱取出的 0.25%胰酶,使其 均匀覆盖瓶底,置于

37 度培养箱中 3-5min,取出,摇晃可发现细胞于底部脱离,将其全部 晃下,加入 3mL

37 度水浴中预热的 10% DMEM,移液枪用 10mL 移液管进行吹打,较大力吹 打6-8 次即可,不留死角,瓶口处较难吹打可将移液管对准培口,小力将培养基打出即可覆 盖到接近瓶口的细胞.之后,将所有细胞吸出,置于 15mL 离心管中,取50ul 混匀后的细胞 于1.5mL eppendorf 管中,加入 450ul 10% DMEM,即为

10 倍稀释,混匀,取10ul 细胞于 计数板中计数.计数板上共

4 大格,每大格

16 小格.计数时,4 大格均计数,总数除以

4 (得每大格细胞数),再乘以 10(10 倍稀释),即为实际 n 万/mL 细胞浓度.传代当天记 为第一天,若第二天进行转染,铺900-1000 万/T75;

若第三天转染,铺350-400 万/T75. 每瓶 T75 加10mL 10%DMEM 培养基.转染当天观察细胞密度,80-90%满即可进行转染.转 染前无需换培养基.

(三)做脂转 complex DMEM 需在

37 度水浴中预热,LipoFiter TM 转染试剂需恢复至室温方可使用,使用前需摇 匀. 转染每瓶 T75 的complex 成分如下: pspax 10μg PMD2G 10μg pHBLV TM 系列载体 10μg 转染后 6h 换新鲜培液. 慢病毒载体构建及包装操作手册 公司地址: 上海市徐汇区斜土路

1175 号15 楼E-mail:[email protected] Tel:021-51296258 http://www.hanbio.net 实验室地址:上海市张江高科技园区蔡伦路

720 弄张江药谷孵化器

1 号楼

314 -

39 - 注:LipoFiter TM 转染试剂为汉恒生物产品,使用说明参考 LipoFiter TM 说明书.

(四)病毒收集 转染后

48 和72h 分别两次收集病毒上清(24h 收集后置换新鲜培液), 收集后以 0.45 μm 滤器过滤,于40 mL 超速离心管中,4℃,72000g/min 离心

120 分钟;

(五)病毒重悬和保存 500ul 新鲜培养液重悬病毒沉淀,置于-80 度甚至液氮保存.

五、感染目的细胞

(一)细胞准备 将状态良好的目的细胞接种到

24 孔板,使细胞浓度为 1*10

5 /ml 细胞,接种细胞数量 因细胞的生长速度而略有不同,一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于 50% 至70%直接.

(二)病毒感染 1.polybrene 的选择: Polybrene:是带正电的小分子, 与细胞表面的阴离子结合, 提高慢病毒对细胞的感染效 率,通常加入 polybr........