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10 8 个病毒颗粒 *根据特定订购要求,产品组成可能有所调整. 保存条件 收到产品后,请将所有产品-80? C保存 安全注意事项 请按照美国国立卫生研究院NIH推荐的方法处理包括生物安全二级 (BSL_2)的所有样品.请小心操作具有传染性的病毒样品.

6 | P a g e pMir载体图谱 质粒扩增 pMir-microRNA前体或pAD-microRNA前体的甘油菌液在含30ug/ml卡那霉素LB 固体培养基上活化并37℃培养过夜.第二天,至少挑取3个克隆进行质粒小 提.用引物GFP-F对pMir-microRNA前体或pAD-microRNA前体进行5'

端测序, 测序位点位于接头上游

85 nt. 病毒载体扩增 用包括MicroRNA前体腺病毒在内的病毒感染HEK293细胞,对病毒进行扩 增.每轮扩增可使病毒滴度增加10倍. 注:以下步骤建议使用T75培养瓶,可根据实际情况优化具体参数. 1. 转染前一天,在T75培养瓶中接种3-5*106 HEK293T细胞. 2. 取1/2体积的粗提病毒裂解液至培养细胞中.建议使用PFU(空斑形成单 位)>

0.5 或足够在48 h内产生病毒细胞病变效应(CPE)的病毒量. bp

7 | P a g e 3. 感染后24-48 h,每天显微镜下镜检两次,检查单层细胞是否出现细胞病 变效应CPE.当CPE接近完成(即大多数细胞圆形但尚未从瓶上脱落),用 移液管将瓶上的细胞吹洗至培养液中. 4. 收集细胞和培养液.1000 g离心5 min收集细胞.除去上清液,悬浮细胞 用10 mM Tris,pH值8.0,NaCl

100 mM重悬.(T75培养瓶 0.25-0.5ml/ 瓶). 5. 反复冻融细胞3次释放病毒颗粒.3000g 离心10 min,除去细胞碎片.弃 沉淀,保存上清液中的病毒. 6. 病毒上清-80°C冻存或立即进行纯化和滴度测定. 常见问题解答 1. 在使用和操作腺病毒载体时应注意哪些安全性问题? mirAd腺病毒载体是复制缺陷型的人类血清5型腺病毒,E1和E3基因缺 失.使用腺病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令. 应在BL2生物安全二级实验室操作病毒粒子.使用新鲜配制的10%漂白粉 进行消毒操作.操作腺病毒和转染细胞时应始终佩戴手套. 2. 在什么情况下我该选用腺病毒载体作为将microRNA前体导入细胞的工 具? 您应先考虑以下几点: 1. 外源基因需要瞬时表达还是稳定的基因表达? 2. 需转染分裂细胞还是非分裂的细胞? 3.对于靶细胞的潜在免疫原性 4.病毒用来进行体内还是体外基因传递? 腺病毒载体能感染分裂和非分裂细胞.它适用于体内和体外基因传递,转 染效率高,对外源基因瞬时表达量高.但相对于其他病毒载体系统,腺病

8 | P a g e 毒载体在靶细胞中具有相对较高的免疫原性. 3. VP,PFU,IFU的区别是什么?我设计的实验该选用哪个指标? VP(Viral particles) 反映了病毒颗粒的总数(包括活病毒和死病毒).由 于在病毒制备过程中,每次死病毒的比率各不相同,VP并不能真实反映 有活性的病毒数量.PFU(plaque formation unit)代表具有感染活性的 病毒数量.通常情况下,VP/PFU比值为20:1至50:1.IFU(infectious unit)相当于PFU. 我们建议您选用PFU或IFU作为病毒滴度单位,可获得较为一致的实验结 果. 4. 病毒滴度如何测定? 测定腺病毒的滴度有三种常用的方法:(1)空斑形成实验 (2)终点稀 释实验 (3)BAC法 空斑形成实验是一种检测有感染能力的病毒(PFU)的生物学方法.通常 是用一系列病毒稀释液感染单层HEK293细胞,病毒在感染的细胞中繁 殖,最终导致细胞毒性效应并被释放出来.释放的病毒将感染邻近的细 胞,这整个过程将被不断重复,最终导致空斑的形成. 为了阻止病毒扩散并形成新的空斑,在完成最初感染后,要将一层0.5% 的琼脂铺在细胞表面上.病毒滴度(PFU/ml)可通过统计空斑数目获 得.空斑的形成需3周时间. 终点稀释实验类似于空斑形成实验,但更为复杂.病毒滴度的计算公式也 较为复杂. BAC法是检测蛋白浓度,仅适用于纯化后的腺病毒.通常1 ug蛋白 =1X109 VP.