PDF《Leader in Biomolecular Solutions》

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abclonal.com.cn One Step WB 新型一步法快速WB实验有节约实验时间、 检测灵敏度高和背景低等多种优点. 常规的Western Blot间接法检测过程 (封闭, 洗涤, 一抗结合, 洗涤, 二抗结合和洗涤) 需要5-6个小时 (一抗过夜需要时间更久) , 实验流程复杂且需要多步条件优化, 使用一步法抗体 可以在不减弱实验灵敏度的情况下, 将封闭, 洗涤, 一抗结合, 洗涤, 二抗结合合并为一个步骤, 把实验时间锐减为2小时左右. 胶上 的蛋白转移到印迹膜上后, 使用一抗和二抗稀释而成的抗体孵育液短时间孵育印迹膜后, 经简单洗涤, 即可进行发光或显色检测. WB一步法实验流程 WB流程示意图 1. 制胶 根据目的蛋白分子量大小选择合适的分离胶浓度. 2. 电泳 采用恒压模式, 先采用恒压80V, 大约25min后, 蛋白从浓缩胶进入分离胶, 调节电压为恒压120V, 溴酚蓝跑至分离胶底部时, 终止 电泳. 3. 转膜 根据目的蛋白分子量大小选择合适的转膜条件. 注意, 若使用PVDF膜, 需将膜放入甲醇中活化. 4. 抗体孵育 转膜完成后, 用TBST洗膜2-3次, 除去残留的转膜缓冲液. 将一抗按1:1000稀释比, 二抗按1:4000稀释比同时加入3%脱脂牛奶中, 室温孵育2个小时. 5. 洗膜 抗体孵育完成后, TBST洗膜5min*4次6. 曝光 蛋白样本制备 SDS-PAGE/电泳 转膜 一抗孵育 洗膜 封闭/洗涤 一抗二抗同时孵育 封闭/洗涤 二抗孵育 一步法 洗膜 检测 传统法