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2 图1. 试剂盒检测原理图 试剂盒组分 试剂盒组分 试剂盒组分 试剂盒组分: : : : (1)蛋白酶 K(PROTEINASE K):2mg/ml 的蛋白酶 K 溶解在 10mM Tris 溶液中(pH8.0);

用来 消化细胞,增加样本的通透性. (2)5*TdT 平衡缓冲液(5X TdT EQUILIBRATION BUFFER):1 M Sodium Cacodylate,0.15 M Tris,1.5 mg/ml BSA,3.75 mM CoCl2,pH 6.6;

使用前需

5 倍稀释. (3)生物素片段末端标记反应混合物(Biotin-FragELTM LABELING REACTION MIX):3 管;

生 物素标记和未标记的脱氧核糖核苷酸以最佳的比例混合,在末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT 酶) 的作用下标记 DNA 片段末端. (4)终止缓冲液(STOP BUFFER):0.5M EDTA,pH8.0. (5)封闭缓冲液(BLOCKING BUFFER):4% BSA 溶于 PBS 溶液中. (6)50*偶联物(50*CONJUGATE):50*链霉亲和素标记过氧化物酶偶联物. (7)DAB 片:HRP 底物,0.7mg/片. (8)双氧水/尿素片:1.6mg/片. (9)甲基绿:0.3%复染用甲基绿. (10)TdT 酶(TdT ENZYME):将标记和未标记的脱氧核糖核苷酸掺入断裂的 DNA 3'

-OH 末端. 注意:TdT 酶在-20℃保存时不会凝固,因此不需要提前取出融化,只需在使用前迅速从-20℃冰箱中 拿出取用后立即放回-20℃保存. (11)HL-60 细胞阳性/阴性对照片:提供两张相似的固定细胞甩片,都是用 0.5?g/ml 放线菌素 D 处理19 小时的 HL-60 细胞,含有已诱导凋亡细胞和未凋亡细胞,可作为凋亡阳性和阴性对照. 注意:其他组分也在使用后尽快放回-20℃冰箱保存.为了避免试剂损失,使用前可以低速短暂离心 融化后的试剂,然后小心开管取用. 默克生命科学服务热线 默克生命科学服务热线 默克生命科学服务热线 默克生命科学服务热线: : : :400-820-8872 邮箱 邮箱 邮箱

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3 实验准备 实验准备 实验准备 实验准备: : : : 实验需用到的仪器耗材有:光学显微镜、小型染色缸、湿盒(塑料/玻璃容器与吸水纸)、冰盒、 洗瓶、盖玻片、封口膜、各种规格的移液器及枪头等. 除试剂盒提供的组分外, 需自备的实验试剂有: 二甲苯、 梯度稀释乙醇溶液 (100%、 90%、 80%、 70%)、30%过氧化氢溶液、10mM Tris 溶液(pH8.0)、TBS 缓冲液(1X TBS,20 mM Tris pH 7.6,

140 mM NaCl)、DNA 酶Ⅰ、1mM MgSO4 PBS 缓冲液(选用,用于制备样本阳性对照片)、DNA 酶Ⅰ(选用,用于制备样本阳性对照片)、封片剂(如Permount)等. 注意事项 注意事项 注意事项 注意事项: : : : 为了获得最佳的实验结果,请在操作前认真阅读以下注意事项. (1) TdT 酶在-20℃保存时不会凝固,因此不需要提前取出融化,只需在使用前迅速从-20℃冰箱 中拿出取用后立即放回保存;

其他组分除封片剂外,在使用时也需放置在冰上,并在使用后 尽快放回-20℃冰箱保存.为了避免试剂损失,使用前可以低速短暂离心融化后的试剂,然 后小心开管取用.避免不必要的反复冻融. (2) DAB 溶液有潜在致癌性,在操作前必须穿戴好手套、实验服和护目镜.不要吞咽. (3) 5*TdT 平衡缓冲液中含有的二甲砷酸盐有毒且潜在致癌,在操作前必须穿戴好手套、实验 服和护目镜.不要吞咽. (4) 针对不同的样本类型,比如石蜡包埋组织切片,组织冰冻切片、固定细胞片等,各有不同的 操作流程, 请根据实验的样本类型参考相应的操作流程. 对照的 HL-60 细胞片需按照固定细 胞片的操作流程操作. (5) 蛋白酶 K 孵育时间,DNase I 处理时间及标记反应时间需根据细胞类型,样本制备步骤摸索 摸索 摸索 摸索 最适条件 最适条件 最适条件 最适条件.以说明书中的条件为初始参考标准. (6) 在标记反应中,推荐使用盖片或封口膜覆盖样本,保证反应液均匀分布,并避免孵育过程中 缓冲液蒸发损失.准备覆盖膜时,可剪下一片 Parafilm?封口膜,使其稍大于样本,并将一角 折起便于在接下来实验步骤中取放. (7) 用塑料或玻璃容器及纸巾自制湿盒,在样本处理过程中使用湿盒保持样本存放环境的湿润, 一定 一定 一定 一定避免样本干燥 避免样本干燥 避免样本干燥 避免样本干燥. (8) 悬浮细胞可用以下方法固定或贴附在玻片上:4°C 缓慢离心(1000rpm)5 分钟,去除细胞培 养上清,并将细胞重新悬浮在 4%的甲醛溶液(溶于 1*PBS 溶液)使其终密度为 1*106 /ml, 室温孵育