PDF《免疫印迹（Western Blot）的基本原理、实验步骤及 FAQ》

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DetaiBio.com [email protected] 活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤及 FAQ 查看 Western blot 实验问题:Western Blot 的常见问题(FAQ) 本文介绍免疫印迹(Western Blot)的基本原理,实验步骤及常见问题(FAQ), 并提供免费 PDF 下载 Western Blot 原理 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质, 探针 是抗体, 显色 用标记的二抗. SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离,转移到固相载体――例如硝酸纤维素薄膜(NC)上.固相载体可以吸附蛋 白质,并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.转移后的 NC 膜就称为一个印迹(blot),用蛋白溶液(如5%BSA 或脱脂奶粉溶液)处理,封闭 NC 膜上的疏水结合位点.用目标蛋白的抗体(一抗)处理 NC 膜――只有 待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物,这样清洗除去未结合的一抗后,只有在目标蛋白的位置 上结合着一抗.用一抗处理过的 NC 膜再用标记的二抗处理,二抗是指一抗的抗体,如一抗是从鼠中获得的,则二 抗就是抗鼠 IgG 的抗体.处理后,带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置,即是待研究的 蛋白质的位置. Western Blot 实验试剂及仪器 1.试剂准备 (1)甲醇 (2)转移缓冲液(Tris5.8g 甘氨酸 2.9g SDS 0.37g 甲醇 200ml V=1L) (3)一抗,二抗 (4)PBST,PBS,Tween-20 (5)显影液(5X): 自来水(加热至 50℃) 375ml (以下药品加到温水中) 米吐尔 1.55g, 亚硫酸钠(无水) 22.5g,碳酸钠(无水) 33.75g,溴化钾 20.95g,补水至 500ml (6)定影液: 自来水(50~60℃) 700ml (以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者) Tel: (025) 5889-

4959 www.DetaiBio.com [email protected] 活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 硫代硫酸钠 240g,亚硫酸钠 (无水) 15g,冰乙酸 12.6ml, 硼酸 7.5g, 钾明矾 15g (水温冷至 30℃ 以下时再加入),加水定容至 1000ml,室温保存 2.材料准备 转膜用的夹子,两块海绵垫,一支滴管,两张滤纸,一张 PVDF 膜,转膜槽,转移电泳仪,摇床,计时器, 磁力搅拌器,转子,Western blot 盒,一块 SDS-PAGE 胶,脱脂奶粉 实验步骤

(一) 配胶 1. 将玻璃板洗净,最后用 ddH2O 冲洗,将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干. 2. 分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP 及TEMED 外) ,过滤后作为储存液避光存放于 4℃,可至少存放

1 个月, 临用前取出室温平衡 (否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡) , 加入 10%AP 及TEMED 即可. 3. 封胶:灌入 2/3 的分离胶后应立即封胶,胶浓度10%时用异丁醇或 异戊醇,也可以用 0.1%的SDS,封胶后静置至胶凝固.待胶凝后将封胶液倒掉,如用醇封胶需用大量清水 及ddH2O 冲洗干净,然后加少量 0.1%的SDS,目的是通过降低张力清除残留水滴. 4. 灌好浓缩胶后 1h 拔除梳子,注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形.拨出梳子后用 ddH2O 冲洗 胶孔两遍以去除残胶,随后用 0.1%的SDS 封胶.若上样孔有变形,可用适当粗细的针头拨正.30min 后 上样,长时间有利于胶结构的形成,因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成.(10%的AP 最好现 配现用,如在 4℃存放勿超过两周.30%的丙烯酰胺如有沉淀,最好弃掉) Tel: (025) 5889-

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