PDF《免疫印迹（Western Blot）的基本原理、实验步骤及 FAQ》

(二) 样品处理 培养的细胞(定性) 1. 去培养液后用温的 PBS 冲洗 2~3 遍(冷的 PBS 有可能使细胞脱落) . 2. 对于

6 孔板来说每孔加 200~300uL,60~80℃的1*loading buffer. 3. 刮下的细胞在 EP 管中煮沸 10min,期间 vortex 2~3 次. 4. 用干净的针尖挑丝,将团块弃掉,如果没有团块但有拉丝现象,可将 EP 管置于 0℃后在 14000~16000g 离心 2min,再次挑丝.若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠,可使用 1ml 注射器反复抽吸来降低溶液粘 滞度,便于上样. 5. 待样品恢复到室温后上样. 培养的细胞(定量) 1. 去培养液后用温的 PBS 冲洗 2~3 遍(冷的 PBS 有可能使细胞脱落) . 2. 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上 10~20min. 3. 刮下的细胞收集在 EP 管后超声(100~200w)3s,2 次. 4. 12000g 离心,4℃,2min. 5. 取少量上清进行定量. 6. 将所有蛋白样品调至等浓度,充分混合沉淀后加 loading buffer 后直接上样最好,剩余溶液(溶于 1* loading buffer)可以低温储存,-70℃一个月,-20℃一周,4℃ 1~2 天,每次上样前 98℃,3min. 组织 1. 心肝脾肾等组织可每 50~100mg 加1ml 裂解液,肺100~200mg 加1ml 裂解液.可手动或电动匀浆.注 意尽量保持低温,快速匀浆. 2. 12000g 离心,4℃,2min. 3. 取少量上清进行定量. 4. 将所有蛋白样品调至等浓度,充分混合沉淀加 loading buffer 后直接上样最好,低温储存剩余溶液(溶于 1*loading buffer) ,每次上样前 98℃,3min.

(三)SDS-PAGE 电泳(不用染色!) 使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带. 关于 SDS-PAGE 实验操作原理及 FAQ 参考 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Tel: (025) 5889-

4959 www.DetaiBio.com [email protected] 活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions

(四) 转膜 电泳结束前

20 分钟左右戴上手套开始准备

1、准备:转移缓冲液(Tris5.8g 甘氨酸 2.9g SDS 0.37g 甲醇 200ml V=1L) 、转膜用的夹子、两块海绵垫、 一支滴管、2 张滤纸、一张 PVDF 膜.

2、剪切滤纸和膜时一定要戴一次性 PE 手套,避免手上的蛋白污染膜.转膜前,PVDF 膜应在甲醇溶液中浸泡 5-10 秒,浸湿为止,在平衡液中平衡(甲醇的作用是固定大分子蛋白,使小分子物质易转移出去)

3、 将转膜用的夹子、 两块海绵垫、 一支滴管、

2 张滤纸、 一张 PVDF 膜浸泡在转移缓冲液中, 然后取出 SDS-PAGE 胶,将浓缩胶轻轻刮去,并在胶的一角做一缺角作为标记以区分上样顺序.将胶在转膜缓冲液中浸泡 5min 左右,以平衡离子强度.

4、夹子打开平放底部黑色电极(阴极),放一张海绵垫片,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡.在海绵垫片上 放置

1 张转移缓冲液浸泡过的滤纸,对齐,然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡,必要时可滴加转膜液润湿. 取出浸在转膜液中的凝胶平放在滤纸上,排除所有气泡.将PVDF 膜置于聚丙烯酰胺凝胶上,玻棒来回擀几遍 排除所有气泡,注意在膜的正面作上标记(可以将膜的一角剪去或用签字笔在膜的边角上做记号) .在膜上盖一 张转移缓冲液浸泡过的滤纸,同样须确保不留气泡.最后盖上另一张海绵垫,盖上阳极板(白色) ,夹紧.保证 对凝胶有一定压力.

5、将夹子放入转移槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面.转膜时将转移槽放入冰水中进行. 转膜过程中电转液用磁力搅拌器搅拌.一般用恒压 110V 转移 60min.对于大分子量的蛋白(超过 120KD) , 时间约 80min.特别要注意加强降温措施. Tel: (025) 5889-